(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210139718.3 (22)申请日 2022.02.16 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 马洪菊　何顺　毛植尧　冯唐奇　 (74)专利代理 机构 北京知文通达知识产权代理 事务所(普通 合伙) 16051 专利代理师 刘江良 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 利用LAMP快速检测抗ALS类除草剂稗草ALS 基因突变的方法 (57)摘要 本发明公开了一种快速检测抗ALS类除草剂 稗草 （Echinochloa  Beauv.） 的ALS基因W574L突 变的引物和方法， 本发明有助于基层植保单位快 速了解稗草抗药性情况、 准确制定杂草防治策 略、 避免草害爆发。 检测方法如下： 1） 提取稗草基 因组DNA； 2） 建立反应体系， 在63℃下扩增60   min； 3） 在80℃下 终止反应后， 在反应产物中加入 荧光显色剂或利用2％琼脂糖凝胶电泳检测是否 发生扩增， 并以此确定是否存在抗性突变。 本发 明可以用极短的时间检测杂草抗性突变， 不需要 昂贵的仪 器， 节约了高额的测序费用。 权利要求书2页 说明书6页 附图2页 CN 114525357 A 2022.05.24 CN 114525357 A 1.一种基于环介导等温扩增快速检测抗ALS类除草剂稗草 （ Echinochloa  Beauv.） ALS 基因W574L突变的方法， 其特征在于， 针对拟检测的样品通过下述引物进行环介导等温扩 增， 并进行检测； 其中， 所述引物如下： F3: CAACCAACACCTGGGTATGG B3: TTCCTGGTGCGGGACAAT FIP: GCTCTCAT TCTCTGGGTTCCCCTGGTGCAGTTGGAGGACA BIP: GAAGAGCGAAGTACGTGCAGCAGATATC CAACAGGTACGGCC。 2.如权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 反应 体系按25 μL计， 具体如下： 组分 （浓度） 添加量 （ μL） 终浓度 10 x ThermoPo lbuffer 2.5 1 x 甜菜碱 （4.5 M） 5.0 0.9 M dNTPs （10 mM） 3.5 1.4 mM MgSO4 （10 0 mM） 1.5 6 mM FIP （40 μM） 1.5 2.4 mM BIP （40 μM） 1.5 2.4 mM F3 （5 μM） 1 0.2 mM B3 （5 μM） 1 0.2 mM Bst DNA聚合酶 （8 U ·μL ‑1） 1 0.32 U·μL ‑1 DNA模板 1 无菌水 5.5 总体积 25 。 3.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 反应条件是在63℃条件下进行扩增反应60   min， 反应结束后， 在80℃条件下放置10  min用于终止反应。 4.如权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述检测方法如下： 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 如果未有条带， 说明结果为阴性， 即不存在突变； 若出现有条 带， 说明结果 为阳性即存在所述 突变。 5.如权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述检测方法如下： 直接在扩增产物中加入1   µL的1000 x SYBR Green Ι， 在正常光照下 呈橙色， 在紫外光下荧光反应弱， 说明结果为阴性即不存在突变） ； 在正常光下呈绿色， 在紫外 光下出现强荧 光反应， 说明结果 为阳性即存在所述 突变。 6.一种基于环介导等温扩增快速检测抗ALS类除草剂稗草 （ Echinochloa  Beauv.） ALS 基因W574 L突变的引物， 其特 征在于， 所述引物如下： F3: CAACCAACACCTGGGTATGG B3: TTCCTGGTGCGGGACAAT FIP: GCTCTCAT TCTCTGGGTTCCCCTGGTGCAGTTGGAGGACA BIP: GAAGAGCGAAGTACGTGCAGCAGATATC CAACAGGTACGGCC。 7.如权利要求1至5任一项所述的方法在鉴定抗ALS类除草剂稗草 （ Echinochloa   Beauv.） 是否具有抗 性中的应用。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114525357 A 28.如权利要求6所述 的引物在鉴定抗ALS类除草剂稗草 （ Echinochloa  Beauv.） 是否具 有抗性中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114525357 A 3