(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221014083 0.9 (22)申请日 2022.02.16 (71)申请人 福建农林大 学 地址 350002 福建省福州市仓山区上 下店 路15号 (72)发明人 王全溪　陆芍华　 (74)专利代理 机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 专利代理师 彭琴　蔡学俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种FAdV -4 NP株特异性引物及其在重组酶 介导等温核酸扩增检测中的应用 (57)摘要 本发明提供一种FAdV ‑4 NP株特异性引物及 其在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用， 属 于畜牧兽医技术领域。 本发明以FAdV ‑4 NP株 ORF19A基因 （GenBank:KU991797.1） 作为靶序列 设计特异性引物FAdV ‑4‑ORF19A F3:5 '‑ ACCTCAGAACCAACTACTGCTGCTACTAC ‑3';FAdV‑4‑ O R F 1 9 A  R 3 : 5 ' ‑ ATGAATACGGCAATGATAACACTGAGACAGAC ‑3'； 并应 用于重组酶介导等温核酸扩增 （RAA） 快速诊断技 术。 与常规PCR比较， 本发明所设计的特异性引物 灵敏性好， 特异性强， 适合畜牧兽医生产一线用 于FAdV‑4的诊断。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图4页 CN 114480737 A 2022.05.13 CN 114480737 A 1.一种FAdV ‑4 NP株特异性引物， 其特征在于： 所述FAdV ‑4 NP株特异性引物的核酸序 列如下： FAdV‑4‑ORF19A F3:5'‑ACCTCAGAACCAACTACTGCTGCTACTAC ‑3'; FAdV‑4‑ORF19A R3:5'‑ATGAATACGGCAATGATAACACTGAGACAGAC ‑3'。 2.权利要求所述一种FAdV ‑4 NP株特异性引物在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应 用， 其特征在于： 所述应用包括以下步骤： （1） FAdV ‑4 NP株病毒DNA提取； （2） RAA反应检测禽腺病毒血清4型： 反应体系： ddH2O15.5 μL， 缓冲液25 μL， 10 μmol/L的FAdV ‑4‑ORF19A F3/FAdV‑4‑ORF19A  R3引物各2 μL， DNA模板3 μL， 280mmol/L的乙酸镁2.5 μL； 所有成分除乙酸镁外全部同时加入 预先冻干有S SB 800ng/ μL， uvsX  120ng/ μL， DNA聚合酶3 0ng/ μL0.2mL的反应管； 反应条件： 反应 体系混合均匀， 在3 5‑43℃温度条件下恒温反应3 0~50min。 3.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于： 步骤 （2)中所述反应条件为： 反应体系混合 均匀， 在37℃温度条件下恒温反应40mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480737 A 2一种FAdV ‑4 NP株特异性引物及其在重组酶介导等温核酸扩 增检测中的应用 技术领域 [0001]本发明属于畜牧兽医技术领域， 具体涉及一种FAdV ‑4 NP株特异性引物及其在重 组酶介导 等温核酸扩增检测中的应用。 背景技术 [0002]禽腺病毒 （Fowl  adenovirus,  FAdV） 是腺病毒科腺病毒属的一员。 血清4型禽腺病 毒 （FAdV ‑4） 感染可引起包涵体肝炎 ‑心包积液综合征 （hydropericardium  hepatitis   syndrome,  HHS） 。 1987年在巴基斯坦的安卡拉地区该病被首次报道， 因此， 又被称为安卡拉 病。 自2015年夏季开始在我国出现较大范围的爆发。 该病的典型病变特征是心脏肿胀、 出 血， 心包内有大量的黄色透明液体或胶冻样渗出物， 肝肿大、 出血。 3～8周龄的鸡感染常突 然死亡， 初期诊断较为困难， 一般无明显的临床症状， 通常发病7天后， 死亡率逐渐上升。 FAdV‑4给我国乃至全球的家 禽养殖业带来巨大的经济损失， 已成为威胁我国养禽业的重大 疫病之一。 但是目前仍然没有可用于畜牧兽医生产一线的能够快速、 准确、 简便、 灵敏的诊 断FAdV‑4的技术。 [0003]重组酶介导扩增法 （Recombinase  aided amplification， RAA） ， 其利用DNA聚合 酶、 重组酶、 单链结合蛋白在恒温条件下进行核酸扩增， 仅需要在37℃左右反应  30min‑ 60min， 即能得到与P CR 相同的结果。 该方法弥补了PCR检测需要高温和贵重仪器的缺点， 用 时少、 操作简易， 只需一个恒温装置即可。 由于不受仪器的限制， 可以对大量样品进行快速 检测， 具有现场快速诊断的优 越性。 [0004]因此， 本发明设计并筛选了一对针对FA dV‑4的特异性引物， 通过重组酶介导的等 温扩增方法建立了一种快速、 准确、 简便、 灵敏的诊断FAdV ‑4的技术， 其与PCR的符合率达 100%。 发明内容 [0005]本发明的目的在于针对养鸡场现场准确、 快速检测FAdV ‑4难的问题， 提供一种 FAdV‑4 NP株特异性引物及其在重组酶介导等温核酸扩增检测中的应用。 本发明所建立的 RAA诊断技术具有特异性和敏感性 好， 重复性高， 快速、 准确等优点。 [0006]为实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： 一种FAdV ‑4 NP株特异性引物， 其核酸序列如下： FAdV‑4‑ORF19A F3:5'‑ACCTCAGAACCAACTACTGCTGCTACTAC ‑3'; FAdV‑4‑ORF19A R3:5'‑ATGAATACGGCAATGATAACACTGAGACAGAC ‑3'。 [0007]本发明的另一个目的在 于提供一种FAdV ‑4 NP株特异性引物在重组酶介导等温核 酸扩增检测中的应用， 其应用方法包括以下步骤： （1） FAdV ‑4 NP株病毒DNA提取； （2） RAA反应检测禽腺病毒血清4型：说　明　书 1/5 页 3 CN 114480737 A 3