(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210143479.9 (22)申请日 2022.02.16 (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西 路135号 (72)发明人 夏军红　熊莹莹　朱宗贤　林翊隆　 艾春晖　黄丹丹　刘同德　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 段卉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫 星的检测引物及其应用 (57)摘要 本发明属于水产养殖技术领域， 涉及红罗非 鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引 物及其应用。 本发明提供了两对与红罗非鱼越冬 期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物， 包括 核苷酸序列如SEQ  ID NO 1和2所示的引物对一 和核苷酸序列如SEQ  ID NO： 3和4所示的引 物对 二。 本发明根据基因型与表现型间关系鉴定出与 越冬期体色黑斑性状关联的微卫星标记ltbs2_ 3809和ltbs8_4298， 并筛选微卫星标记ltbs2_ 3809基因型为ab同时ltbs8_4298基因型为aa的 作为亲本的基因型， 以有效获得体 色稳定无明显 的黑斑变异的红罗非鱼群体， 保证亲本性状优 良， 进而保证体色稳定 遗传， 提高育种效率。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图5页 CN 114457168 A 2022.05.10 CN 114457168 A 1.红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物， 其特征在于， 包括以下引 物对中的一对或两对， 所述引物对一的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 1和2所示； 引物对二的核 苷酸序列如SEQ  ID NO： 3和4所示。 2.权利要求1所述检测引物在鉴定红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星中的应 用。 3.权利要求1所述检测引物在制备鉴定红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的 试剂盒中的应用。 4.根据权利要求2或3所述应用， 其特 征在于， 所述体色为红色。 5.一种检测 红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的试剂盒， 其特征在于， 包括 权利要求1所述的检测引物。 6.根据权利 要求5所述试剂盒， 其特征在于， 还含有PCR试剂、 PAGE胶电泳试剂和银染显 色试剂。 7.根据权利要求6所述试剂盒， 其特征在于， 所述PCR试剂的反应体系为2 ×PCR DS Mix  8～12 μL， 权利要求1所述检测引物的引物对的上下游引物各0.8～1.2 μL， 模板DNA  2～4 μL， 补充水1.6～8.4 μL至总体积20 μL。 8.根据权利要求6所述试剂盒， 其特征在于， 所述PCR试剂的反应条件为94～95℃预变 性3min， 变性94～95℃30s， 退火55.8℃40s， 延伸70～72℃30s， 循环数为35， 70～72℃延伸 10min。 9.权利要求5或6所述试剂盒在鉴定红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星中的 应用。 10.权利要求1所述引物和/或权利要求5所述的试剂盒在红罗非鱼 分子育种中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114457168 A 2红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关的微卫星的检测引物及其 应用 技术领域 [0001]本发明涉及水产养殖技术领域， 具体地， 涉及红罗非鱼越冬期体色黑斑性状相关 的微卫星的检测引物及其应用。 背景技术 [0002]罗非鱼(Or eochromisspp)是一种原产于非洲的慈鲷科鱼类， 是世界上第二大淡水 养殖鱼类， 仅次于鲤鱼。 红罗非鱼属于鲈形目(Percifoxrnes)， 鲈亚目(Percoidei)， 丽鱼科 (Cichlidae)， 罗非鱼属(Oreochro mis)， 一般认为是由尼罗罗非鱼(O.niloticus)与体色变 异的莫桑比克罗非鱼(O.mossambicus)杂交， 经多代选育而成 的优良品种。 近年来， 因其具 有腹腔无黑膜、 体色艳丽、 口感清新、 适应性强等众多优点， 在东南亚和我国的养殖面积不 断扩大。 红罗非鱼鲜艳的红色体表迎合了中国人对于红色的喜爱， 因此红罗非鱼在中国市 场有着巨大的潜力。 [0003]红罗非鱼体色较为丰富， 据研究报道目前主要存在深红色、 橙色、 金色、 粉红色、 粉 白色等， 呈现的不同体色通常是由其鱼体表皮肤和鳞片含有不同的色素细胞及其不同的数 量分布所致。 色素细胞分布于表皮和肌节之 间的叠加层中， 在鳞片皮肤组织中上得以显现。 胡萝卜素能让红罗非鱼体色鲜艳， 但鱼类本身无法合成， 因此该色素来源于食物而非内源 性合成。 [0004]在生产实际中， 经历越冬期的部分红罗非鱼会出现不同程度的黑斑现象。 体色作 为红罗非鱼重要经济性状之一， 其在冬季体色变黑现象严重影响了其经济价值， 已成为制 约红罗非鱼大规模养殖的重要因素之一。 大部 分由于越冬期诱导的体表黑斑在 恢复适宜温 度后会逐渐褪去， 但小部分会有保留， 然而， 其遗传机制不清楚。 解析越冬期诱导黑斑性状 的遗传机制， 筛选出越冬期体色稳定无黑斑的红罗非鱼亲本， 对于进行优良红罗非鱼的选 育， 提高育种效率 来说具有至关重要的作用。 [0005]获得越冬期体色鲜亮无黑斑且稳定遗传的红罗非鱼对于解决当前制约红罗非鱼 生产养殖问题及提高市场价值至关重要。 王兰梅等通过研究KEGG通路分析， 发现黑色素合 成、 Wnt和MAPK  3种信号通路很可能影响了红罗非鱼的体 色变异过程(王兰梅,朱文彬,董在 杰.3种不同体 色的红罗非鱼皮肤转录组分析比较[ C]//2015年中国水产学会 学术年会论文 摘要集.2015.)； 但是， 目前国内外关于红罗非鱼越冬期黑斑性状的遗传机制仍 不清楚。 [0006]数量性状基因座(QTL)是指控制数量性状的基因在 基因组中的位置， 基于QTL进行 性状关联的分子标记育种， 分子标记育种是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的 特点， 通过检测分子标记， 即可检测到目的基因的存在， 达到选择目标性状的目的一种新型 育种方法， 具有快速、 准确、 不受环境条件干扰的优点。 现有技术中虽然也有关于黑斑体色 红罗非鱼的分子标记， 如中 国发明专利公开了红罗非鱼皮肤组织的miR ‑138‑5p， 可作为 “黑 斑”和“红斑”体色的红罗非鱼mi RNA分子标记， 通过该分子标记可广泛用于红罗非鱼 品种鉴 别、 保种和分子辅助选择育种， 但是该分子标记是针对 “黑斑”和“红斑”体色的红罗非鱼， 并说　明　书 1/8 页 3 CN 114457168 A 3