(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221014280 3.5 (22)申请日 2022.02.16 (71)申请人 山东师范大学 地址 250014 山东省济南市历下区文化 东 路88号 (72)发明人 张春阳　胡娟　魏雪茹　 (74)专利代理 机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 372 21 代理人 李筝 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种无标记荧 光检测FEN1活性的方法 (57)摘要 本发明涉及一种无标记荧光检测FEN1活性 的方法。 本发 明提供了一种基于连接反应介导的 超支化滚环扩增方法用于无标记荧光检测FEN1 活性的方法； 通过环形DNA底物识别FEN1， 并以环 形DNA序列作为模板实现超支化滚环扩增。 该方 法操作简单， 经济有效， 特异性强， 可以超灵敏检 测FEN1。 此外， 它还可用于筛选FEN1抑制剂和定 量检测癌细胞中的FEN1活性， 在临床诊断和药物 发现方面具有巨大的潜在应用价 值。 权利要求书2页 说明书7页 序列表1页 附图4页 CN 114410793 A 2022.04.29 CN 114410793 A 1.一种无标记荧光检测FEN1活性的方法， 其特征在于， 所述检测方法涉及环形DNA底 物、 引物1及引物 2； 所述环形DNA 底物由带5’分枝结构的挂锁探针与辅助探针杂交形成； 所述检测方法包括以下步骤： 将环形DNA底物 投入待测 样品中混合孵育诱导裂解， 裂解 后所述环形DNA底物中分支结构被切除暴露出5 ’端磷酸基团的缺口； 将裂解反应产 物与DNA 连接酶混合， 通过DNA连接酶对上述缺口进行连接获得闭合的环形序列； 将连接反应产物、 核酸外切酶I及 核酸外切酶III混合， 对环形DNA底物中的辅助探针进行消化； 将消化反应产 物、 引物1和引物2及dNTPs混合升温孵育一段时间后加入DNA聚合酶， 以闭合的环形序列为 模板引发超支化滚环扩增， 对 扩增产物进行定量检测即可获得 FEN1活性。 2.如权利要求1所述无标记荧光检测FEN1活性的方法， 其特征在于， 所述的检测方法 中， 所述环形DNA底物由挂锁探针及辅助探针杂交形成， 所述挂锁探针5 ’端向3’端方向为一 段单核苷酸链及环形序列， 所述单核苷酸链即为分支结构， 所述环形序列两个末端与辅助 探针配对， 在辅助探针的作用下成环， 形成挂锁探针。 3.如权利要求2所述无标记荧光检测FEN1活性的方法， 其特征在于， 所述环形DNA底物 的制备方式如下： 将挂锁探针及辅助 探针加入含MgCl2的Tris缓冲液 中加热孵育， 孵育完成 后缓慢冷却至室温形成； 所述孵 育温度为90～10 0℃， 所述孵 育时间为3～8mi n； 或， 所述引物1能够识别 并结合挂锁探针的环形序列并进行延伸， 所述引物2能够识别 上述延伸序列实现超支化滚环扩增。 4.如权利 要求1‑3任一项所述无标记荧光检测FEN1活性的方法， 其特征在于， 所述挂锁 探针、 辅助探针、 引物1及引物 2的序列分别如下： 挂锁探针： TTT  TAG AAC TAT ATT GTC TTT CTC TGA TTC TGA CTC GTC ATG TCT CAG  CTT TAG TTT AAT ACG ACT CCA TAG GGC TCA GTG TGA TTC CAC CTT CTC CAA； 辅助探针： CAG  AGA AAG ACA ATA TAG TTC TTG GAG AAG GTG GAA TCA CAC TGA G； 引物1： CTA  AAG CTG AGA CAT GAC GAG TC； 引物2： CTC AGT GTG ATT CCA CCT TCT CC。 5.如权利要求1所述无标记荧光检测FEN1活性的方法， 其特征在于， 所述诱导裂解的反 应中， 孵育温度为5 0～60℃， 孵育时间为25～3 5min； 或， 所述DNA连接酶为Taq  DNA连接酶， 所述连接反应的温度为40～50℃， 反应时间为25 ～35min； 或， 所述消化反应的温度为34～40℃， 反应时间为25～35min， 随后在75～85℃下反应 15～25min终止反应； 或， 所述滚环扩增反应温度为6 0～70℃， 反应时间为80～10 0min； 或， 所述DNA聚合酶为Vent(exo ‑)DNA聚合酶； 或， 所述定量检测方式为 荧光定量检测。 6.如权利要求5所述无标记荧光检测FEN1活性的方法， 其特征在于， 所述定量检测方式 如下： 将滚环扩增产物与荧光染料混合， 通过荧光光谱仪测量荧光发射光谱； 具体的， 所述 荧光染料为SYBR  Green I， 在488nm的激发波长下， 在5 00‑650nm范围内记录发射 光谱； 或， 所述定量检测方式如下： 以SYBR  Gold作为荧光指示剂， 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析滚环扩增反应产物。 7.一种用于FEN1检测的试剂组合， 其特征在于， 所述检测试剂中至少包括环形DNA底权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114410793 A 2物、 DNA连接酶、 DNA聚合酶及引物。 8.如权利要求7所述用于FEN1检测的试剂组合， 其特征在于， 所述检测试剂中还包括缓 冲液； 进一 步的， 所述缓冲液至少包括缓冲液A、 缓冲液B、 缓冲液C、 及缓冲液D； 所述缓冲液A为15～25mM的Tris ‑HCl缓冲液， 其中还具有(NH4)2SO4、 KCl、 MgSO4及 Triton‑X‑100 所述缓冲液B为15～25mM的Tris ‑HCl缓冲液， 其中还具有醋酸钾、 醋酸镁、 NAD、 DTT及 Triton X‑100； 所述缓冲液C为6 0～70mM的甘 氨酸‑KOH缓冲液， 其中还具有MgCl2及β‑ME； 所述缓冲液D为5～15mM的Bis ‑Tris‑Propaneuc ‑HCl缓冲液， 其中还具有MgCl2及DTT； 优选的， 所述试剂组合中还包括定量相关的试剂， 进一步的， 采用荧光检测进行定量， 所述定量相关试剂包括 荧光染料， 具体的实例为SYBR  Green I或SYBR Gold。 9.权利要求1 ‑6任一项所述无标记荧光检测FEN1活性的方法和/或权利要求7或8所述 用于FEN1检测的试剂组合在FEN1定量检测领域的应用； 所述在FEN1定量检测领域的应用包括但不限于以下任意 一个方面： (1)FEN1相关检测产品的制备； (2)样品中FEN1含量的测定； (3)FEN1抑制剂/ 激动剂的筛 选。 10.如权利 要求9所述无标记荧光检测FEN1活性的方法和/或用于FEN1检测的试剂组合 在FEN1定量检测领域的应用， 其特 征在于： 所述第(1)方面的应用中， 所述FEN1相 关的检测产品包括但不限于检测试剂盒或检测 仪器； 所述第(2)方面的应用中， 所述样品为细胞核提取物， 进一 步的， 为肿瘤 细胞核提取物。 所述第(3)方面的应用中， 所述FEN1抑制剂/激动剂的筛选方式如下： 将待测的抑制剂 或激动剂加入已知浓度的FEN1样品中， 并对加样后样品中FEN1的活性进行测定 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114410793 A 3