(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210145503.2 (22)申请日 2022.02.17 (71)申请人 中国农业科 学院植物保护研究所 地址 100193 北京市海淀区 圆明园西路2号 申请人 中国检验检疫科 学研究院 (72)发明人 王旭　彭德良　葛建军　彭焕　 雷荣　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11562 专利代理师 王颖 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种马铃薯金线虫RPA-LFD快速检测方法及 应用 (57)摘要 本发明公开了一种马铃薯金线虫RPA ‑LFD快 速检测方法及应用， 属于生物技术领域。 本发明 公开了马铃薯金线虫 RPA‑LFD快速检测引物和探 针， 其特征在于， 所述引物序列为如SEQ  ID NO:1 所示上游引物序列和SEQ  ID NO:2所示下游引物 序列， 所述探针序列如SEQ  ID NO:3所示。 利用上 述引物和探针构建了RPA ‑LFD检测方法， 通过对 马铃薯金线虫DNA提取， 马铃薯金线虫 RPA体系等 温扩增， 采用LFD试纸条可特异快速检测出马铃 薯金线虫。 本发明的检测方法具有特异性强、 灵 敏度高、 操作简便， 在马铃薯金线虫快速检疫检 测方面具有很高的应用价 值。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图3页 CN 114438226 A 2022.05.06 CN 114438226 A 1.一种马铃薯金线虫RPA ‑LFD快速检测引物和探针， 其特征在于， 所述引物序列为如 SEQ ID NO:1所示上游引物序列和SEQ  ID NO:2所示下游引物序列， 所述探针序列如SEQ  ID  NO:3所示。 2.如权利要求1所述的引物和探针， 其特 征在于， 所述下游引物的5＇ 末端添加Bi otin。 3.如权利 要求1所述的引物和探针， 其特征在于， 所述探针的5＇ 末端添加Fam， 5'末端和 3'末端的中间加入一个四氢呋喃， 3'末端添加Spacer ‑C3亚磷酰胺。 4.一种马铃薯金线虫RPA ‑LFD快速检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑3任一项 所述的引物和探针。 5.如权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括试纸条， 所述试纸条为链霉亲和素 和Fam抗体修饰金纳米标记的核酸检测试纸条。 6.如权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括DNA提取试剂， 所述DNA提取试剂包 括裂解液A和裂解液B。 7.一种马铃薯金线虫RPA ‑LFD快速检测方法， 其特征在于， 利用权利要求1所述的引物 和探针进 行RPA反应， 将RPA反应的最终产 物点到LF试纸条上， 静置观 察结果， 根据 观察的结 果判断是否为马铃薯金线虫。 8.如权利要求7 所述的方法， 其特 征在于， RPA反应 体系包括： 1)反应混合液： 再水化液25μL， 上游引物和下游引物各2.1μL， 探针0.6μL， 醋酸镁2.5μ L， 上述所有的溶 液溶解于酶干粉中， 加灭菌双蒸馏水补充到48 μL； 2)2 μL DNA模板。 9.如权利要求8所述的方法， 其特征在于， RPA反应条件为： 将所述反应混合液和DNA模 板混合均匀后， 37～40℃温育 30min。 10.如权利要求1所述的引物和探针， 或者权利要求2所述的试剂盒， 或者权利要求7所 述的方法的应用， 其特 征在于， 应用于如下(a) ‑(c)任一项： (a)检测进出口植物产品中携带马铃薯金线虫的情况； (b)检测土壤中马铃薯金线虫发生情况； (c)鉴定马铃薯金线虫。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438226 A 2一种马铃薯金线虫R PA‑LFD快速检测方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 特别是涉及一种马铃薯金线虫RPA ‑LFD快速检测方法 及应用。 背景技术 [0002]马铃薯金线虫(Globodera  rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera   pallida)统称马铃薯孢囊线虫(Potato  cyst nematode， 简称PCN)， 是一类对马铃薯具有高 度专化性和经济重要性的有害生物。 PCN作为单一病原侵染危害马铃薯， 可造成其减产 30％。 该线虫是马铃薯生产上重要的检疫性有害生物。 PCN繁殖力高， 且在不良环境条件下 可以存活很久， 因此一旦种群建立后很难彻底根除。 目前马铃薯金线虫在我国局部地区发 生， 为我国的内、 外检重要的检疫性有害生物。 PCN形态学特征非常相 似， 难以区分， 传统的 马铃薯胞囊线虫鉴定方法必须借助于一定数量特征性的孢囊或雌虫， 并结合2龄幼虫特征 进行鉴别， 因此马铃薯孢囊线 虫检测的专 业性特别强， 同时还需要有足够数量的标本。 为了 保护我国农业生产 的安全， 防止马铃薯 白线虫传入我国及马铃薯金线虫在我国的传播扩 散， 开展马铃薯 孢囊线虫的特异快速的分子检测技 术研究具有重要的现实意 义。 [0003]马铃薯孢囊线虫的分子鉴定的研究始于上世纪80年代， 研究人员利用蛋白电泳技 术， 基于马铃薯白线 虫和马铃薯金线 虫的蛋白差异， 开 发设计了多 条特异性探针， 可以用来 检测并区分两种PCN。 利用血清学技术， Schots等筛选获得了PCN的两个种的特异性的单克 隆抗体， 可以对其进 行定量鉴定。 以分类为目的的核酸检测技术始于198 5年， 但当时的核酸 检测方法耗时较长、 需要大量的核酸且不灵敏。 随着PCR技术的不断优化， 反应灵敏度和效 率不断提高， 促使仅利用少量的材料即可实现检测。 PCR方法更适合用来研究线 虫DNA。 通过 设计了PCR引物， 对PCN两个种进 行扩增， 检测PCR的产物可以很好地区分两种 马铃薯孢囊线 虫。 以PCR技术为基础， 基于DNA分子多态 性发展而来的各种分子标记 技术在PCN的检测鉴定 应用中均有涉及， 如RAPD、 AFLP、 RFLP、 实时荧光PCR和一些恒温扩增的技术LAMP在检测PCN 中也有应用。 [0004]重组酶聚合酶扩增技术(RPA)2006年由英国Olaf  Piepenburg组首次提出， 并且该 技术已用于检测多种病原物， 如Subbotin(2018)利用RPA扩增了象耳豆根结线虫IGS  rRNA 片段序列， 并用实时荧光检测其扩增产物， 灵敏度为 1/10的二龄幼虫。 鞠 玉亮(2019)建立了 南方根结线虫、 爪哇根结线虫、 花生根结线虫和象耳豆根结线虫的RPA快速检测方法。 迟元 凯(2020)建立了爪哇根结线虫RPA ‑LFD检测方法， 37 ‑42℃恒温条件下20min内即可实现阳 性样品的可视化检测结果。 但在马铃薯金线虫 上尚无相关报道。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种马铃薯金线虫RPA ‑LFD快速检测 方法及应用， 以解决上 述现有技术存在的问题， 通过设计RPA特异性引物和LFD特异性探针， 建立了马铃薯金线虫 的RPA‑LFD快速检测方法， 能够高灵敏度、 特异性的快速检测马铃薯金线虫。说　明　书 1/6 页 3 CN 114438226 A 3