(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210146044.X (22)申请日 2022.02.17 (71)申请人 山东省农业科 学院畜牧兽医研究所 地址 250100 山东省济南市历城区桑园路8 号 (72)发明人 齐鹏飞　张伟　杨少华　杨宏军　 朱曼玲　张亮　唐月新　解晓莉　 高星熠　张诗悦　 (74)专利代理 机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 李桂存 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 马冠状病毒一步法RT-PCR检测试剂盒及其 应用 (57)摘要 本发明属于试剂盒领域， 本发 明涉及一种检 测试剂盒及这种检测试剂盒在非疾病检测的使 用方法， 具体涉及一种马冠状病毒一步法RT ‑PCR 检测试剂盒及其应用。 通过设计引物采用RT ‑PCR 的方法， 得到了一种特异、 敏感、 快速、 使用方便、 廉价的用于检测马冠状病毒的一步法RT ‑PCR检 测试剂盒， 同时提供这一试剂盒在马属 动物病毒 性腹泻诊断检测中的使用方法。 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图2页 CN 114381555 A 2022.04.22 CN 114381555 A 1.一种马冠状病毒一步法RT ‑PCR检测试剂盒， 其特征在于， 包括两条引物ECoV ‑N‑F、 ECoV‑N‑R； 所述ECoV‑N‑F序列如SEQ  ID No.1所示， 具体为： ACAT TGATGGAGTCTTCT； 所述ECoV‑N‑R序列如SEQ  ID No.2所示， 具体为： CT TTGTGGCATCCTTAC。 2. 根据权利要求1所述的马冠状病毒一步法RT ‑PCR检测试剂盒， 其特征在于， 还包括 A. 一步法RT ‑PCR预混Buffer； B.  扩增酶； C.  阳性RNA对照； D.  阴性RNA对照； E.  RNase  free ddH2O。 3.权利要求1或2所述的马冠状病毒一步法RT ‑PCR检测试剂盒在非疾病诊断目的马冠 状病毒上检测上的应用。 4.权利要求3所述的应用的使用方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 从待检马属动物肠 道组织或粪便样品中提取RNA为模板， 用权利要求1所述的两条引物进行一步法RT ‑PCR扩 增， 根据所扩增的目的片段 大小进行判定待检样品是否感染马冠状病毒。 5. 根据权利要求4所述的使用方法， 其特征在于， 用权利要求1所述的两条引物进行扩 增时， 引物的终浓度为： SEQ  ID No.1和SEQ  ID No.2各40  pmol/L， 反应体系为： 一步法RT ‑ PCR预混Buffer  12.5µL， RNA 2µL， 引物各1 µL， RNase free ddH2O补平至总体系25 µL； 反应 条件为： 50℃  30min； 94℃  5min； 94℃  30s， 55℃  30s， 72℃  10s， 32个循环； 72℃ 延伸7min； 16℃保存； 扩增的片段长度为： 32 9bp。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114381555 A 2马冠状病毒一步法RT ‑PCR检测试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明属于试剂盒领域， 本发明涉及一种检测试剂盒及 这种检测试剂盒在非疾病 检测的使用方法， 具体涉及一种马冠状病毒一 步法RT‑PCR检测试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]马冠状病毒是导致马属动 物 （马、 驴、 骡） 幼驹腹泻的重要传染病之一， 对马属动 物 产业造成严重危害。 临床诊断很难将其与细菌性以及其他病毒性腹泻区分开， 常导致误诊， 因此该病的防控及其早期诊断显得尤为重要。 目前国内尚没有可应用的马冠状病毒商品化 检测试剂盒。 发明内容 [0003]针对现阶段马冠状病毒检测试剂盒的商业化产品欠缺的问题， 本发明通过设计引 物采用RT ‑PCR的方法， 得到了一种特异、 敏感、 快速、 使用方便、 廉价的用于检测马冠状病毒 的一步法RT ‑PCR检测试剂盒， 同时提供这一试剂盒在马属动物病毒性腹泻诊断检测中的使 用方法。 [0004]本发明的技 术方案如下： 一种马冠状病毒一 步法RT‑PCR检测试剂盒， 包括两条引物E CoV‑N‑F、 ECoV‑N‑R； 所述ECoV‑N‑F序列如SEQ  ID No.1所示， 具体为： ACAT TGATGGAGTCTTCT； 所述ECoV‑N‑R序列如SEQ  ID No.2所示， 具体为： CT TTGTGGCATCCTTAC。 [0005]优选地， 所述的试剂盒， 还包括A.  一步法RT ‑PCR预混Buffer； B.  扩增酶； C.  阳性 RNA对照； D.  阴性RNA对照； E.  RNase free ddH2O。 [0006]上述马冠状病毒一步法RT ‑PCR检测试剂盒在非疾病诊 断目的马冠状病毒上检测 上的应用。 [0007]上述应用的使用方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 从待检马属动 物肠道组织或粪 便样品中提取RNA为模板， 用权利要求1所述的两条引物进行一步法RT ‑PCR扩增， 根据所扩 增的目的片段 大小进行判定待检样品是否感染马冠状病毒。 [0008]用上述两条引物进行扩增时， 引物的终浓度为： SEQ  ID No.1和SEQ  ID No.2各40   pmol/L， 反应体系为： 一步法RT ‑PCR预混Buffer  12.5µL， RNA 2µL， 引物各1 µL， RNase free  ddH2O补平至总体系25 µL； 反应条件为： 50℃  30min； 94℃  5min； 94℃  30s， 55℃  30s， 72℃   10s， 32个 循环； 72℃延伸7mi n； 16℃保存； 扩增的片段长度为： 32 9bp。 [0009]本发明主 要是根据 马冠状病毒E CoV464693株的序列设计的引物。 [0010]本发明的有益效果 利用本发明检测试剂盒用于马冠状病毒检测， 其优点在于： 根据病原的保守基因 的高度保守区设计特异性引物。 根据扩增片段长度判断是否马冠状病毒感染， 该方法方便 快捷， 不仅能为对症治疗提供依据， 还 可为马冠状病毒的流行病学调查提供可靠的信息， 为 及时治疗和防控疫情提供最 直接的依据， 为马属动物产业的健康发展保驾护航。说　明　书 1/3 页 3 CN 114381555 A 3