(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210143957.6 (22)申请日 2022.02.17 (71)申请人 重庆市计量质量检测研究院 地址 401121 重庆市渝北区杨柳北路1号 (72)发明人 张明娟　李根容　周昭旭　肖昭竞　 刘明明　秦爱　王娟　袁磊　 余秋地　 (74)专利代理 机构 重庆博凯知识产权代理有限 公司 50212 代理人 刘桢 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/14(2006.01) C12Q 1/10(2006.01)C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测十种食源性致病菌多重PCR检测用 引物及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种检测十种食源性致病菌 多重PCR检测用引物及试剂盒， 所述引物的序列 包括SEQ ID NO.1至SEQ  ID NO.19所示的核苷酸 序列。 本发明建立的多重PCR检测方法只需要1次 人工操作和1次PCR反应时间， 降低了大量的人力 成本和时间成本， 且同时检测节省了重复检测同 一个样品的试剂消耗， 大量减少了试剂成本 。 权利要求书1页 说明书16页 序列表4页 附图7页 CN 114277170 A 2022.04.05 CN 114277170 A 1.一种检测十种食源性致病菌多重PCR检测用引物， 其特征在于， 所述引物的序列包括 SEQ ID NO.1至SEQ  ID NO.19所示的核苷酸序列。 2.根据权利要求1所述检测十种食源性致病菌多重PCR检测用引物， 其特征在于， 在制 备用于快速检测十种食 源性致病菌的多重PCR试剂盒中的应用。 3.根据权利要求1所述检测十种食源性致病菌多重PCR检测用引物， 其特征在于， 在利 用多重PCR快速检测十种食 源性致病菌中的应用。 4.一种利用多重PCR同时快速检测十种食源性致病菌的方法， 其特征在于， 提取待检测 产品基因组DNA作为模板， 在引物存在下进 行PCR反应， 对P CR产物进 行电泳分析即完成产品 中食源性致病菌成分的检测； 所述引物的序列为SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.19所示的核苷 酸序列。 5.所述利用多重PCR同时快速检测十种食源性致病菌的方法， 其特征在于， 进行电泳的 条件为： 核酸染料浓度为10 μL/100mL； 电泳液浓度为1 ×TAE； PCR扩增产物上样量为25 μL； 电 泳的电压为2 20V； 时间为 40min； 琼脂糖凝胶浓度分别为1.5%、 2 %、 2.5%。 6.一种检测十种食源性致病菌的多重PCR试剂盒， 其特征在于， 采用权利要求1所述检 测十种食 源性致病菌多重PCR检测用引物制备 得到的试剂盒。 7.根据权利要求6所述检测十种食源性致病菌的多重PCR试剂盒， 其特征在于， 所述检 测十种食源性致病菌的多重PCR试剂盒还包括所述试剂盒包括2 ×Multiplex  PCR  MasterMix、 Taq酶、 阳性质控 模板、 去离 子水。 8.根据权利要求6所述检测十种食源性致病菌的多重PCR试剂 盒在利用多重PCR同时检 测十种食源性致病菌中的应用， 或者权利要求 1所述检测十种食源性致病菌的多重P CR试剂 盒在制备多重PCR同时检测十种食 源性致病菌用试剂盒中的应用。 9.根据权利 要求8所述的应用， 其特征在于， 多重PCR的升温程序 为95℃预变性4min； 95 ℃变性30s， 55.0℃复性30s， 55.7℃复性30s， 56.9℃复性30s， 58.8℃复性30s， 61.1℃复性 30s， 63.0℃复性30s， 64.3℃复性30s， 65℃复性30s， 72℃延伸1min共35个循环； 最后72℃延 伸10min。 10. 根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 多重PCR反应体系如下： Mix  buffer为35 μL； Taq酶为1μL； 引物量为10 μM， 各为0.1μL、 0.2 μL、 0.3 μL、 0.4 μL、 0.5 μL； DNA模板量分别为 10ng、 25ng、 5 0ng； 补充d d H2O至50 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114277170 A 2一种检测十种食源性致病菌多重PCR检测用引物及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学快速检测技术领域， 具体涉及一种检测十种食源性致病菌 多重PCR检测用引物及试剂盒。 背景技术 [0002]目前， 我国开展食源性致病菌检测主要依靠传统的培养法， 包括细菌培养、 血清 学、 生化鉴定等过程， 依据标准主要是GB  4789系列和GB8538。 传统培养法检测时受微生物 生长情况影响较大， 并且其检测周期长， 一般需要4 ‑7天， 操作也繁琐复杂， 十分耗时耗力， 已不能满足我国公共卫 生突发事件应急检测的需要。 [0003]近年来， 分子生物学技术发展十分迅速， 致病菌检测标准在制定中从传统的培养 方法逐渐转变为分子生物学方法， 查阅目前现行标准， 在致病菌检测中主要利用的分子生 物学技术为传统聚合酶链式反应(Polymerase  chain reaction， PCR)技术、 实时荧光定量 PCR技术、 环介导恒温扩增(Loop ‑mediated  Isothermal  Amplification,LAMP)技术、 数字 微滴PCR技术等。 分析其标准类别， 发现使用分子生物学技术的标准基本都是行业标准、 地 方标准， 而使用范围最广的国家强制性标准GB4789和GB8538， 还 是以传统的培养方法为主， 仅在2017年实施的GB  4789.6‑2016 《食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏 菌检验》 、 GB  4789.12‑2016 《食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检 验》 、 2020年实施的GB  4789.29‑2020 《食品安全国家标准食品微生物学检验唐菖蒲伯克霍 尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)检验》 中用到传统PCR技术， GB  4789.42‑2016 《食品安 全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》 中用到实时荧光定量P CR技术。 这主要 是由于 实时荧光定量PCR技术、 数字微滴PCR技术对实验室人员、 仪器要求较高， 检测成本也较高， 限制了其在实验室大范围普及 使用， 而LAMP技术虽对仪器要求较低， 但引物设计较为困难， 往往需要设计几对GC含量合适， 打分较高的优质 引物组， 在序列条件不是特别好的情况下， 较难实现， 大范围使用也存在困难。 强制性标准中目前仅有GB  4789.42‑2016利用实时荧光 定量PCR技术， 主要是因为病毒检测对实验室能力要求较高， 具有这一能力的实验室在人 员、 仪器配置上本来就处于国内较高水平。 而传统PCR技术相比于荧光定量PCR、 数字微滴 PCR等技术， 操作简单， 检测成本也较低， 这也是近年来国家强制性标准逐渐使用这一技术 的原因。 发明内容 [0004]针对现有技术存在的上述不足， 本发明的目的在于提供一种检测十种食源性致病 菌多重PCR检测用引物， 以解决现有技术常规食品微生物检测方法操作较为繁琐且耗时长 的问题。 [0005]为了解决上述技术问题， 本发明提供一种检测十种食源性致病菌多重PCR检测用 引物， 所述引物的序列包括SEQ  ID NO.1至SEQ  ID NO.19所示的核苷酸序列。 [0006]本发明提供一种利用多重PCR同时快速检测十种食源性致病菌的方法， 提取待检说　明　书 1/16 页 3 CN 114277170 A 3