(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210145062.6 (22)申请日 2022.02.17 (71)申请人 海南省农业科 学院热带园艺研究所 地址 571100 海南省海口市流 芳路9号 (72)发明人 赵慧琪　任军方　赵慧琳　黄赛　 李栋梁　张浪　蔡嘉慧　 (74)专利代理 机构 重庆一叶知秋专利代理事务 所(普通合伙) 50277 专利代理师 刘洪雨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 海南省火焰兰S SR-PCR反应 体系及其应用 (57)摘要 本发明属于分子生物学技术领域， 具体公开 了一种海南省火焰兰SSR ‑PCR反应体系， 包括 Primer‑F、 Primer ‑R、 DNA聚合酶、 DNA模板。 本发 明还公开了 上述海南省火焰兰SSR ‑PCR反应体系 在海南省火焰兰SSR分子标记及辅助育种中的应 用， 以及在制备检测试剂盒中的应用。 本发明提 供的海南省火焰兰SSR ‑PCR反应体系稳定性佳， 分辨率佳， 可重复性高， 能够扩增出清晰、 明亮、 特异的电泳条带， 为后期引物的开发奠定重要的 实验基础。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 114480711 A 2022.05.13 CN 114480711 A 1.海南省火焰兰SSR ‑PCR反应体系， 其特征在于， 包括Primer ‑F、 Primer ‑R、 DNA聚合酶、 DNA模板； Primer‑F的序列和Primer ‑R的序列包括S SR1‑SSR11任一组或两组以上； SSR1‑11的序列如下： SSR1中， Primer ‑F： TGGCATTTGACATGCAG GTG； Primer‑R： ACACCTCGGGCAAAAATCAA； SSR2中， Primer ‑F： TGGTGGTGTATATGCAGA ATAGT； Primer‑R： CGCCAATATTAGATCCGGGCT； SSR3中， Primer ‑F： GAGTTGACACACACACGCAC； Primer‑R： CCAATTGGGCCGTTAAAGTGG； SSR4中， Primer ‑F： TTGAATGGGAGGAGTTCGGC； Primer‑R： ACCGATGCAACCTGGATGTC； SSR5中， Primer ‑F： CGAGTG GTCAGAGTGC CAAT； Primer‑R： TTCTCCATGAGGCGAAACCC； SSR6中， Primer ‑F： GGCTTTCACTGGGCTAGACA； Primer‑R： GGAGGGGCTTTTGTTGACCT； SSR7中， Primer ‑F： TCCCTTCTTCTCTCTCTCGCT； Primer‑R： AGGAAGAGTGTTTGAGTTAATACCT； SSR8中， Primer ‑F： AGTGGTCATCCAAACAAGGGA； Primer‑R： TGTGTACA AGAAAGCCAGCA； SSR9中， Primer ‑F： CCCAGCCTATGTGACTGACA； Primer‑R： ACTCTCATA AGTTGCTGATAGC CT； SSR10中， Primer ‑F： GGCGTCTTGGATCTCAG GTC； Primer‑R： TGGCTATGTG GTTTTCCTTCA； SSR11中， Primer ‑F： TGTGACG GAAATTTTGGTGCA； Primer‑R： GCCCAATAATCGCACA ACGT。 2.根据权利要求1所述的海南省火焰兰SSR ‑PCR反应体系， 其特征在于， 扩增程序 为： 94 ℃ 3min； 94℃ 30s， 56℃ 30s， 72℃ 30s， 35个循环； 72℃  30min。 3.根据权利要求1或2所述的海南省火焰兰SSR ‑PCR反应体系在海南省火焰兰SSR分子 标记及辅助育种中的应用。 4.根据权利 要求1或2所述的海南省火焰兰SSR ‑PCR反应体系在制备检测试剂盒中的应 用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480711 A 2海南省火焰兰S SR‑PCR反应体系及其应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域， 尤其涉及一种海南省火焰兰SSR ‑PCR反应体系 及其应用。 背景技术 [0002]火焰兰(Renanthera  coccinea)为兰科万代兰族(Vandeae)指甲兰亚族 (Aeridinae)火焰兰属  (Renanthera)植物， 以其绚丽如火的花色而得名， 是极具特色和 观 赏价值的一类热带珍稀兰花。 火焰 兰具有花序呈大圆锥型， 花小 数量多， 花期 长， 花梗长， 耐 高温、 高湿， 喜阳等特点， 可广泛用于切花、 园林布景、 绿篱和盆栽等方面。 火焰兰属约有20 个种， 主要分布于亚洲的热带地区和太平洋岛屿。 我国有云南火焰兰(R.imschooliana)、 火 焰兰和中华火焰兰(R.si nica)3种， 主 要分布于云南、 贵州、 海南 等地。 [0003]目前， 国内外对火焰兰的研究还主要集中在对云南火焰兰的离体快速繁殖(林丹 妮等， 2006)， 种 子无菌萌发和试管育苗(林丹妮等， 2008)， 杂交育种(曹雯静等， 2014； 陈和 明等， 2019)， 通过查阅文献、 标本记录、 实地群落及种群现状调查相结合的方法来分析火焰 兰的种群现状(李娟 等， 2018)  等方面。 研究人员对海南省火焰兰资源的研究可能比较晚， 仅发现在2015年才有报道， 如姚婧通过相关序列扩增多态性(sequence ‑related   amplified  polymorphi sm,SRAP)技术对8份海南省火焰兰栽培资源进行了遗传多样性分析 (姚婧， 2015)， 但是此项研究样本量比较少， 而且样本并非海南省野生资源， SRAP标记的物 种特异性 不具优势， 因此， 不能反应整个海南省火焰兰的种质资源情况。 [0004]SSR(simple  sequence  repeat)分子标记具有多态性高、 标记数量多、 重复性好、 覆盖面广等优点， 已广泛应用于分子标记辅助选择、 遗传多样性分析和遗传图谱构建等领 域。 目前常用的SSR标记开发策 略有建库法、 微卫星富集法、 近缘物种引物筛选法和生物信 息学分析法。 其中， 建库法作较复杂、 开发效率低、 对实验室设备仪器要求比较高、 耗时长， 只适用于对基因组信息了解 非常少的物种进 行标记开 发； 微卫星富集法与文库法相比省略 了构建文库的步骤， 但是该方法还需要用PCR的方法获得SSR分子标记的侧翼序列， 操作更 加繁琐； 近缘物种引物筛选法， 需要有近缘物种的SSR信息且对于亲缘关系较远的物种引物 的通用性较差， 在一定程度上限制 了这种方法的应用； 生物信息学分析法方法是采用软件 在NCBI、 EMBL据库中搜索EST序列中的SSR分子标记或者对已经完成基因组测序、 转录组测 序的物种进 行搜索， 找出其中的SSR分子标记， 根据SSR分子标记的侧翼序列设计引物， 利用 样品对设计的引物进行筛选， 从而筛选出含有SSR分子标记的具有多态性的引物。 由于EST 序列和转录组测序序列数据量很大， 这种 方法与其他SSR开发方法相比仍然具有很高的开 发效率(夏峰梅,2016)。 此外， 这种方法开发的SSR位于基因的编码区， 得到的SSR分子标记 往往与基因紧密连锁， 可以有效的进 行基因定位和与性状的关联分析， 得到功能性SSR分子 标记。 因此基于转录组数据开 发的SSR标记 不仅有利于对种质资源的遗传多样性评价， 更有 利于后期与重要性状进行关联分析， 这也将为分子标记辅助育种工作中亲本选育过程节约 了时间和成本 。说　明　书 1/8 页 3 CN 114480711 A 3