(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210150665.5 (22)申请日 2022.02.18 (71)申请人 武汉凯德维斯医学检验实验室有限 公司 地址 430223 湖北省武汉市东湖新 技术开 发区高新二路388号武汉光谷国际生 物医药企业加速器3.1期15栋2层 （1） 厂房 (72)发明人 陈世民　杨帆　何良　王志杰　 黄晓园　 (74)专利代理 机构 北京君有知识产权代理事务 所(普通合伙) 11630 专利代理师 焦丽雅 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6874(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种制备人乳头瘤病毒捕获探针组的方法 及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种制备高危型人乳头瘤病 毒捕获探针组的方法及其应用， 属于基因检测及 分子遗传学领域； 本发明通过以15种高危型质 粒:HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66和68为模板， 利用滚环扩增的方法扩增 出覆盖HPV全长的扩增产物； 进一步将扩增产物 超声打断至不同需求的长度， 即为能特异性捕获 15种HPV基因组的探针； 本发明能降低HPV捕获探 针组制备成本， 并 能缩短探针组制备周期。 同时， 本发明的探针组能够准确的检测高危型HPV的感 染及整合状态。 权利要求书1页 说明书7页 序列表51页 附图1页 CN 114480739 A 2022.05.13 CN 114480739 A 1.一种制备高危型 人乳头瘤病毒捕获探针组的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)、 合成15种高危型HPV的DNA序列， 并构建载体， 所述高危型HPV为： HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 5 3、 56、 58、 59、 6 6和68中的一种或多种； (2)、 合成扩增引物； (3)、 使用修饰标记的dNTP为原料、 以步骤(1)的质粒分别为模板， 用步骤(2)所述的引 物进行滚环式扩增； (4)、 获得的扩增产物定量， 并混合； (5)、 纯化 步骤(4)获得的混合产物并用超声打断仪打断。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述15种高危型HPV的DNA序列为： SEQ  ID  NO.1‑15中的一种或多种。 3.如权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述引物的序列为： SEQ  ID  NO.16。 4.如权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)中所述dNTP原料包括dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP和dUTP， 其中只有dU TP带生物素 标签。 5.如权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)中所述滚环式扩增使用的酶为 Phi29DNA聚合酶。 6.如权利要求1或2所述的方法， 其特 征在于， 步骤(4)中扩增产物混合 为等比例混合。 7.如权利 要求1或2所述的方法， 其特征在于， 步骤(5)中超声的参数设置为： 超声30秒， 停20s， 共60个循环。 8.一种HPV捕获探针， 其特 征在于， 使用如权利要求1所述的方法制备。 9.权利要求8所述捕获探针在检测HPV整合状态中的应用， 其特征在于， 包括以下几个 步骤： (1)、 样本DNA提取、 片段化、 构建DNA文库； (2)、 用权利要求1所制备的探针组与所构建的文库杂交， 进行HPV序列靶向捕获及定 量； (3)、 高通 量测序； (4)、 基因序列的生物信息分析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480739 A 2一种制备人乳头瘤病毒捕获探针组的方 法及其应用 技术领域： [0001]本发明属于基因检测及分子遗传学领域， 具体涉及一种可用于15种高危型人乳头 瘤病毒基因 组捕获探针的制备 方法及其应用。 背景技术： [0002]宫颈癌是指发生于子宫颈阴道和宫颈部的恶性肿瘤， 是最常见的妇科恶性肿瘤之 一， 仅次于乳腺癌。 人乳头瘤病毒(Human  Papillomavirus,HPV)是一种无被膜包被的环状 双链小分子DNA病毒， 基因组长约8000碱基对(base  pair,bp)。 大量研究表明， 高危型HPV (HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66和68)持续感染是导致宫颈上皮内瘤 变及宫颈癌的主要原因。 尽管如此， 不是每一个感染高危型HPV的患者均发生了宫颈癌。 随 着分子生物学和细胞遗传学的进展， 科学研究发现HPV  DNA与宫颈上皮细胞基因组整合事 件的发生才 是宫颈癌发生过程中的重要环节。 HPV  DNA一旦插入到 宫颈上皮细胞基因组中， HPV DNA序列将会随着人基因组的复制不 断复制， 引起癌蛋白的持续表达。 同时， 宫颈上皮 细胞基因组结构及相关基因的表达水平会发生变化， 增加上皮细胞基因组的不稳定性， 导 致宫颈上皮细胞功能异常、 分裂失控， 最 终致癌。 目前， HPV基因组整合事件是宫颈上皮内瘤 变向宫颈癌恶性转化的一个重要 标志已得到一致认可。 在HPV 导致的良性病变中， 细胞内的 病毒DNA通常以游离形式位于宫颈上皮基因组外。 在高级别病变和宫颈癌中， HPV  DNA通常 以整合形式插入至上皮细胞基因组中， 且整合率 随着宫颈病变的严重程度而显著增加。 因 此， HPV与人基因组整合可作为宫颈高级别病变及宫颈癌的辅助诊断手段。 高通量测序技术 结合靶向捕获技术是目前检测HPV整合状态最为准确的方法。 HPV靶向捕获的核心材料之一 是HPV DNA捕获探针， 目前市场上主要DNA捕获探针生产厂商有罗氏(Roche)、 IDT (Integrated  DNATechnologies)、 Twist  Bioscience， 目前三家公司都是采用直接合成 oligo的方案。 然而， 直接合成探针方案的成本较高， 引起DNA探针市场价格居高不下， 且合 成周期长 。 发明内容: [0003]针对上述问题， 本发明的目的是提供一种用于高危型人乳头瘤病毒基因组捕获探 针组的制备 方法及其应用。 所述制备 方法简单、 产量大、 成本低， 可将制备周期缩短至1 天。 [0004]为实现上述目的， 本发明采用以下技 术方案： [0005]一种制备用于高危型HPV基因组捕获测 序的DNA捕获探针的方法， 依次包括如下步 骤： [0006](1)合成15种高危型HPV:HPV16(SEQ  ID NO.1)、 18(SEQ  ID NO.2)、 31(SEQ  ID  NO.3)、 33(SEQ  ID NO.4)、 35(SEQ  ID NO.5)、 39(SEQ  ID NO.6)、 45(SEQ  ID NO.7)、 51(SEQ   ID NO.8)、 52(SEQ  ID NO.9)、 53(SEQ  ID NO.10)、 56(SEQ  ID NO.11)、 58(SEQ  ID NO.12)、 59(SEQ ID NO.13)、 6 6(SEQ ID NO.14)和68(SEQ  ID NO.15)， 并克隆至pUC 57载体； [0007](2)合成扩增引物， 所述引物的核苷酸序列为: SEQ ID NO.16；说　明　书 1/7 页 3 CN 114480739 A 3