(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210150220.7 (22)申请日 2022.02.18 (71)申请人 天筛 （上海） 科技有限公司 地址 201318 上海市浦东 新区天雄路58 8弄 1-28号第10幢3层3 01室 申请人 天罗诊断科技江苏有限公司 (72)发明人 王继国　张帆　陈普　李振海　 (74)专利代理 机构 上海领匠知识产权代理有限 公司 31404 专利代理师 汤蔚莉 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种RNA病毒病原体的直扩检测方法 (57)摘要 本发明属于生物诊断领域， 具体涉及一种 RNA病毒病原体的直扩检测方法。 本发明公开了 一种RNA病毒病原体的直扩检测方法， 包括下列 步骤： a.受试者样品采集； b.混合扩增； c.PCR扩 增检测或qPCR扩增检测。 本发明所述方法颠覆性 取消了本领域RNA检测过程中反转录步骤， 灵敏 度可达到100copies/ml， 远超过现有的一步法 RT‑qPCR， 且本发明方法全部检测时间30多分钟， 而现有的一步法RT ‑qPCR需要2小时。 因此本发明 方法特别适合发热门诊， 海关检疫， 居家及社区 等现场即时检验的应用需求。 权利要求书2页 说明书16页 附图2页 CN 114622037 A 2022.06.14 CN 114622037 A 1.一种RNA病毒病原体的直扩检测方法， 其特 征在于， 包括下列步骤： a.受试者样品采集； b.混合扩增： 含受试者样品的核酸释放剂和试剂置于密闭容器中， 进行cDNA合成和 cDNA互补链扩增， 所述试剂包括RT ‑PCR或RT‑qPCR所需的组分； c.PCR扩增检测或qPCR扩增检测； 所述步骤b为密闭容器中， 延伸温度下， RNA依赖性DNA聚合酶将RNA逆转录为cDNA链； 将 密闭容器加热到阈值温度， 在所述阈值温度下， RNA:DNA杂交体解链； 将温度降低至延伸温 度， 并从相同的模板RNA分子产生第二条cDNA链， 同时以第一条cDNA链为模板， DNA依赖性 DNA聚合酶合成cDNA互补链； 如此反复循环多次。 。 2.如权利要求1所述的直扩检测方法， 其特 征在于， 所述 步骤b没有荧 光采集的过程。 3.如权利要求1所述的直扩检测方法， 其特 征在于， 所述延伸温度为37℃～6 0℃。 4.如权利要求1所述的直扩检测方法， 其特 征在于， 所述阈值温度为80℃～ 99℃。 5.如权利要求1所述的直扩检测方法， 其特征在于， 所述步骤b扩增条件为延伸温度55 ℃～58℃， 10S～3 0S,阈值温度90℃～ 95℃， 小于 5S,循环10次以下。 6.如权利要求1所述的直扩检测方法， 其特征在于， 所述步骤b前增加UNG去除PCR产物 污染步骤， 反应条件为37℃， 1～5mi n。 7.如权利要求1所述的直扩检测方法， 其特征在于， 所述受试者为哺乳动物、 禽鸟、 鱼类 或环境物质。 8.如权利要求1的直扩检测方法， 其特征在于， 所述RNA病毒病原体为腺相关病 毒、 艾滋 病毒、 澳大利亚蝙 蝠狂犬病毒、 BK多瘤病毒(BK  polyomavirus)、 版纳病毒、 巴马森林病毒、 布尼奥罗病毒、 拉克罗斯布尼亚病毒、 雪兔布尼亚病毒、 弥猴疱疹病毒、 金迪普拉病毒、 基孔 肯雅病毒、 柯萨病毒A、 牛痘病毒、 柯萨奇病毒、 克里米亚 ‑刚果出血热病毒、 登革热病毒、 多 里病毒、 道格比病毒、 杜文哈格病毒、 东部马脑炎病毒、 埃博拉病毒、 艾柯病毒(Echovirus)、 脑心肌炎病毒、 爱泼斯坦 ‑巴尔病毒、 欧洲蝙蝠狂犬病毒、 GB病毒C/庚型肝炎病毒、 汉坦病 毒、 亨德拉病毒、 甲型肝炎病毒、 乙型肝炎病毒、 丙型肝炎病毒、 戊型肝炎病毒、 丁型肝炎病 毒、 马痘病毒、 人腺病毒、 人星状病毒、 人冠状病毒、 人巨细胞病毒、 人肠道病毒68， 70、 人疱 疹病毒1、 人疱疹病毒2、 人疱疹病毒6、 人疱疹病毒 7、 人疱疹病毒8、 人类免疫缺陷病毒、 人乳 头瘤病毒1、 人乳头瘤病毒2、 人乳头瘤病毒16， 18、 人副流感病毒、 人细小病毒B19、 人呼吸道 合胞病毒、 人鼻病毒、 人SARS冠状病毒、 人逆转录病毒、 人T淋巴细胞性病毒、 人环曲病毒、 甲 型流感病毒、 乙型流感病毒、 丙型流感病毒、 伊斯法罕病毒、 JC多瘤病毒、 日本脑炎病毒、 呼 宁砂粒样病毒、 KI多瘤病毒、 昆津病毒、 拉哥斯蝙蝠病毒、 维多利亚湖马尔堡病毒、 兰加特病 毒、 拉沙病毒、 洛兹达雷病毒、 跳跃病病毒、 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、 马丘波病毒、 马 雅罗病毒、 中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒、 麻疹病毒尤库尼米、 孟戈脑心肌炎病毒、 默克 尔细胞多瘤病毒、 莫科拉病毒、 传染性软疣病毒、 猴痘病毒、 腮腺炎病毒、 墨累山谷脑炎病 毒、 纽约病毒、 尼帕病毒、 诺沃克病毒、 阿尼昂尼昂病毒、 口疮病毒、 奥罗普切病毒、 皮秦德病 毒、 脊髓灰质炎病毒、 庞塔托鲁静脉病毒、 普马拉病毒、 狂犬病病毒、 裂谷热病毒、 罗莎病毒 A、 罗斯河病毒、 轮状病毒A、 轮状病毒B、 轮状病毒C、 风疹病毒、 鹭山病毒、 萨利病毒A、 白蛉热 西西里病毒、 扎幌病毒、 塞姆利基森林病毒、 汉城病毒、 猴泡沫病毒、 猴病毒5、 辛德毕斯病 毒、 南汉普顿病毒、 圣路易斯脑炎病毒、 蜱传播的玻瓦桑病毒、 细环病毒、 托斯卡纳病毒、 病权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114622037 A 2毒、 牛痘病毒、 水痘带状疱疹病毒、 天花病毒、 委内瑞拉马脑炎病毒、 水泡性口炎病毒、 西部 马脑炎病毒、 WU多瘤病毒、 西尼罗病毒、 雅巴猴肿瘤病毒、 雅巴样疾病病毒、 黄热病病毒、 寨 卡病毒、 或新型 冠状病毒中之一。 9.如权利要求1所述的直扩检测方法， 其特征在于， 所述试剂包括RT ‑PCR或RT‑qPCR所 需的组分。 10.如权利 要求1所述的直扩检测方法， 其特征在于， 所述PCR扩增或qPCR扩增采用高速 定量PCR仪 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114622037 A 3