(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221014857 7.1 (22)申请日 2022.02.18 (71)申请人 道之精准医学 科技 （上海） 有限公司 地址 201620 上海市松江区龙腾路1015弄6 号406室 (72)发明人 李光　刘佳　丁国徽　黄敏　 谢利剑　 (74)专利代理 机构 上海未可期专利代理事务所 (普通合伙) 31360 代理人 余佳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于川崎病检测的引物组、 探 针及试剂盒 (57)摘要 本发明提出了一种用于川崎病检测的引物 组、 探针及试剂盒， 属于分子生物学技术领域， 包 括反转录引物、 扩增引物和探针序列， 所述核酸 序列组合能够有效定性/定量检测人血液血小板 中的miR ‑125a‑5p、 hsa‑miR‑3182、 hsa ‑miR‑ 3675‑5p、 miR‑4433b‑5p和miR‑126， 其中miR ‑126 作为内参标志物。 本发明采集的是血小板中的 miRNA， 血小板相较于外泌体而言更易获得， 且含 量丰富， 提取方法简单。 本发明设置了特异性的 miRNA内参基因， 方法更为合理， 联合分析4种 miRNA， 准确度远远大于 单一生物标准物的检测， 降低假阳性的发生， 更易区分川崎病与普通发热 等情况。 权利要求书3页 说明书11页 序列表4页 附图3页 CN 114277127 A 2022.04.05 CN 114277127 A 1.一种用于川崎病检测的核酸序列组合， 包括反转录引物、 扩增引物和探针序列， 其特 征在于， 所述核酸序列组合能够有效定性/定量检测人血液血小板中的miR ‑125a‑5p、 hsa‑ miR‑3182、 hsa ‑miR‑3675‑5p、 miR‑4433b‑5p和miR‑126， 其中miR ‑126作为内参标志 物； 其中， 反转录引物序列如下： miR‑125a‑5p‑sl ： CAGGGCATCAGCCTGAACCCTGAACCCTGAATAACCT   GAAACTGATGC CCTGTCACAG； hsa‑miR‑3182‑sl ： ACGGGAAACTGAGTTCAGTTCCCAGCGTCCATATCAG   TTCCCAGTTTCCCGTGACTAC； hsa‑miR‑3675‑5p‑sl： CAGGGCATCAGCCTGAACCCTGAACCCTGAATAAC   CTGAAACTGATGC CCTGGAAATC； miR‑4433b‑5p‑sl ： CTTGATGGCTGCCCGTCAAGCCAGTCAAGTATCCAGT   CAAGTCAGCCATCAAGACAGGA； miR‑126‑sl： TTAGGGTCAGGCCTGAACCCTGAACCCTGAATGCGAACTG ACCTGACCCTAACGCATT； 扩增引物序列如下： 正向引物： miR‑125a‑5p‑F： CCTGAACCCTGAACCCTGA； hsa‑miR‑3182‑F： AGTTCAGTTCCCAGCGTCC； hsa‑miR‑3675‑5p‑F： CCTGAACCCTGAACCCTGA； miR‑4433b‑5p‑F： CCCGTCAAGCCAGTCAAGT； miR‑126‑F： CCTGAACCCTGAACCCTGA； 反向引物： miR‑125a‑5p‑R： GGTCCCTGAGACCCTTTAAC； hsa‑miR‑3182‑R： TGCGCGCT TCTGTAGT； hsa‑miR‑3675‑5p‑R： CCTCTATGGGGCTTCTGTAGA； miR‑4433b‑5p‑R： GATGTC CCACCCCCAC； miR‑126‑R： GAGCTCGTAC CGTGAGTA AT； 探针序列如下： miR‑125a‑5p‑P： AACCTGAAACTGATGC CCTG； hsa‑miR‑3182‑P： ATCAGT TCCCAGTTTCCCGT； hsa‑miR‑3675‑5p‑P： AACCTGAAACTGATGC CCTG； miR‑4433b‑5p‑P： CCAGTCAAGTCAGCCATCAAG； miR‑126‑P： GCGAACTGACCTGACCCTAA。 2.一种用于川崎病检测的试剂 盒， 其特征在于， 包括反转录试剂、 扩增试剂和如权利要 求1所述的探针序列， 所述探针核苷酸序列的5 ’端标记有荧光报告基团， 3 ’端标记有荧光淬 灭基团， 所述探针核苷酸序列的荧光报告基团为FAM、 HEX、 VIC、 ROX、 Cy5中的至少一种， 荧光 淬灭基团为BHQ1、 BHQ2、 MGB中的至少一种； 所述反转录引物序列为权利要求1所述的反转录 引物； 扩增引物为权利要求1所述的正向引物和反向引物。 3.一种检测芯片或装置， 其包括权利要求1所述的反转录引物、 扩增引物和探针序列。 4.权利要求1所述的反转录引物、 扩增引物和探针序列在制备川崎病的预测、 辅助诊断权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114277127 A 2川崎病的试剂或工具中的应用。 5.权利要求1所述 的核酸序列组合在制备定性和/或定量检测miR ‑125a‑5p、 hsa‑miR‑ 3182、 hsa ‑miR‑3675‑5p、 miR‑4433b‑5p和miR‑126试剂中的用途。 6.一种检测目的基因miR ‑125a‑5p、 hsa‑miR‑3182、 hsa‑miR‑3675‑5p、 miR‑4433b‑5p和 内参基因miR ‑126的方法， 包括如下步骤： 1)从样品中提取血小板miRNA， 加入反转录引物miR ‑125a‑5p‑sl、 hsa‑miR‑3182‑sl、 hsa‑miR‑3675‑5p‑sl、 miR‑4433b‑5p‑sl和miR‑126‑sl进行反转录， 得到 cDNA； 2)以cDNA为模板， 使用正向引物和反向引物进行扩增反应， 扩增反应的同时加入探针 序列， 对扩增产物进行RT ‑qPCR分析， 判断目的基因和内参基因的miRNA的荧光定量反应Ct 值， 计算核酸标志 物的表达量R； 所述正向引物包括miR ‑125a‑5p‑F、 hsa‑miR‑3182‑F、 hsa‑miR‑3675‑5p‑F、 miR‑4433b‑ 5p‑F、 miR‑126‑F； 所述反向引物包括miR ‑125a‑5p‑R、 hsa‑miR‑3182‑R、 hsa‑miR‑3675‑5p‑R、 miR‑4433b‑ 5p‑R、 miR‑126‑R； 所述探针序列包括miR ‑125a‑5p‑P、 hsa‑miR‑3182‑P、 hsa‑miR‑3675‑5p‑P、 miR‑4433b‑ 5p‑P、 miR‑126‑P； 其中， 反转录引物、 扩增引物和探针序列如权利要求1所述。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述扩增反应 体系和条件如下： Premix Ex Taq （Probe  qPCR） （2X） ： 10 μl； 引物： F/R各0.4 μl； 探针： 0.8 μl； cDNA： 1 μl； ddH2O： 补足至20 μl； 反应条件： 95℃3 0s， 1个循环； 95℃5s， 6 0℃34s， 40个 循环。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述反转录包括： 基因组DNA去除步骤和 cDNA合成步骤； 其中， 所述基因 组DNA去除步骤中反应 体系如下： 5x gDNA Wiper Mix： 2 μl； Template RNA： 50ng； RNase‑free water： 补足至10 μl。 反应条件如下： 42℃， 2mi n； 4℃， ∞； 所述cDNA合成步骤中反应 体系如下： 反转录引物 （10 μm） ： 1 μl； 上一步的混合液： 10 μl； RNase‑free water： 5 μl； 10x RT Mix： 2 μl； HiScript  Ⅱ  Enzyme Mix： 2 μl； 反应条件如下： 25℃， 5mi n； 50℃， 15mi n； 85℃， 5mi n； 4℃， ∞。 得到反转录产物， 即cDNA。 9.所述核酸标志 物的表达量R为目的基因的Ct值与内参基因的Ct值的比值。权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114277127 A 3