(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210152485.0 (22)申请日 2022.02.18 (71)申请人 江苏师范大学 地址 221116 江苏省徐州市铜山 新区上海 路101号 申请人 江苏徐淮地区徐州农业科 学研究所 （江苏徐州甘 薯研究中心） (72)发明人 孙厚俊　马居奎　谢逸萍　马代夫　 张成玲　李宗芸　杨冬静　唐伟　 陈晶伟　 (74)专利代理 机构 南京德铭知识产权代理事务 所(普通合伙) 32362 代理人 奚鎏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01)C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于马铃薯腐烂茎线虫遗传多样性分析的 SSR引物组及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于马铃薯腐烂茎线虫 遗传多样性分析的SSR引物组及其应用， 属于分 子标记技术领域。 本发明所述的SSR引物组包括9 对引物， 具有稳定性强、 多态性高、 重复性好等优 点， 适用于马铃薯腐烂茎线虫种群遗传结构分 析， 能有效对马铃薯腐烂茎线虫进行遗传多样性 分析及群 体聚类分析。 权利要求书1页 说明书9页 序列表4页 附图4页 CN 114231646 A 2022.03.25 CN 114231646 A 1.用于马铃薯腐烂茎线虫遗传多样性分析的SSR引物 组， 其特征在于， 包括9对引物， 分 别为DD‑02、 DD‑10、 DD‑27、 DD‑77、 DD‑86、 DD‑88、 DD‑98、 DD‑105、 DD‑133， 其序列如下 所示： 引物名称 正向引物序列(5 ’ ‑3’)反向引物序 列(5’ ‑3’)重复基元 DD‑02 ATAGACCCAGGCTCTCGGATCCCAAGGAAAGAGAGGGAGT (TTG)5 DD‑10 ACCTCCAGGTTGAGGGCTAT GCTTCACCTAAGTCGCAACC(AC)6 DD‑27 TGAGCTCAGA ACCAAGAGCA AGGAGAGACCATAGGAGGGC(CT)7 DD‑77 TGGGCTCATTTGTCTCCATTCCGAAGAATGGCAATCATTT(AT)6 DD‑86 CGTGCTTCAAAGAGGAATGC AGCATTGGGCCAGATGTTAC(GTG)5 DD‑88 TCTGGACGCAACTAAACTGGAAGGGTCTCTCGATC CGATT(CT)7 DD‑98 ACAGATGGCAGGAATGCAACGCGCTAGGACGAAATAGTGG(GA)6 DD‑105 TGCAGGTGCAGACT TTCAATTGCGGAATTTGGTTCCTTAG(TA)6 DD‑133 GGAGCAGTGTGTC CTCCTTCAATGGCCAATGACTGGTCTC (GAC)5 2.根据权利要求1所述的SSR引物组在马铃薯腐烂茎线虫遗传多样性分析中的应用， 其 特征在于， 应用方法包括以下步骤： (1)马铃薯腐烂 茎线虫群 体样本的分离； (2)马铃薯腐烂 茎线虫样本DNA的提取； (3)每对引物的正向引物分别加上AP接头序列， 获得带有AP接头的正向引物， 所述的AP 接头序列为5 ’ ‑CAGTCGGGCGTCATCA ‑3’； 在AP接头序列引物5 ’端带有FA M、 HEX或ROX的特异性 荧光标记， 获得荧 光标记的AP引物； (4)以步骤(2)得到的马铃薯腐 烂茎线虫DNA为模板， 以步骤(3)获得的带有AP接头的正 向引物、 荧 光标记的AP引物和反向引物， 使用三引物法进行PCR扩增， 获得荧 光PCR产物； (5)将步骤(4)得到的荧光PCR产物进行毛细 管荧光电泳检测， 读取毛细 管电泳数据， 统 计条带检测结果； (6)将步骤(5)得到的马铃薯腐烂 茎线虫毛细管电泳条 带信息进行遗传多样性分析。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 步骤(4)中， PCR扩增体系如下： 1μL模板 DNA、 10 μL的2 ×TaqPCR Master Mix、 0.15 μL浓度为10pmol/ μL带有AP接头的正向引物、 1.2 μ L浓度为10pmol/ μL的反向引物、 1.2 μL浓度为10pmol/ μL的荧光标记的AP引物， ddH2O补充至 20 μL。 4.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 步骤(4)中， PCR扩增的反应程序为： 95℃预 变性5min； 95℃变性3 0s， 58℃退火3 0s， 72℃延伸3 0s， 共35个循环； 72℃末端延伸10mi n。 5.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于， 步骤(6)中， 遗传多样性分析的方法为： 利 用ABI3730自动测序仪结合GeneMapper  version 4.1确定微卫星等位基因； 使用GenAlEx   6.5和Cervus  3.0.7软件统计9个位点的等位基因数、 有效等位基因数、 Shannon ’s多样性指 数、 表观杂合度、 预期杂合度和多态信息含量指数； 利用软件Fstat  2.9.3计算群体间的遗 传分化系数； 根据FST＝1/(4Nm+1)， 估算基因流； 基于群体 间的Nei＇ s遗传距离， 利用MEGA  6 对马铃薯腐烂 茎线虫群 体构建UPGMA聚类树。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114231646 A 2用于马铃薯腐烂茎线虫遗传多样性分析的S SR引物组及其 应用 技术领域 [0001]本发明属于分子标记技术领域， 涉及一种用于马铃薯腐烂茎线虫遗传多样性分析 的SSR引物组及其应用。 背景技术 [0002]马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus  destruct or)是重要的植物检疫对象之一， 其寄 主包括马铃薯、 玉米、 烟草、 胡萝卜、 大豆、 番茄、 小麦、 花生等多种作物或真菌。 但目前该线 虫主要危害甘薯， 是北方薯区三大病害(茎线虫病、 黑斑病、 根腐病)的病原之一， 给甘薯产 业发展造成极大的威胁。 马铃薯腐烂茎线 虫的研究多集中于生物学、 形态学、 甘薯 抗病品种 的筛选和病害防控技术等方面， 马铃薯腐烂茎线 虫的种群遗传多样性和种群遗传结构的研 究相对滞后。 [0003]微卫星(Simple  Sequence Repeats， SSR)标记具有数量多、 多态性高、 重复性好和 共显性等优点使其在种群遗传结构和多样性的分析具有一定的优势。 开 发针对于马铃薯腐 烂茎线虫SSR分子标记， 用于 分析该线 虫国内群体间的遗传距离、 遗传分化程度及遗传多样 性差异， 对揭示马铃薯腐烂 茎线虫的起源、 揭示 其传播扩散路径具有重要意 义。 [0004]目前在禾谷孢囊线虫、 大豆孢囊线虫、 松材线虫等植物寄生线虫领域均已成功开 发了SSR分子标记病应用于相关的遗传结构和遗传多样性研究中， 但在马铃薯腐烂茎线虫 中尚无相关的报道。 发明内容 [0005]本发明的目的在于提供一种用于马铃薯腐烂茎线虫遗传多样性分析的SSR引物组 及其应用。 [0006]为了实现上述目的， 本发明采用以下技 术方案： [0007]用于马铃薯腐烂茎线虫遗传多样性分析的SSR引物组， 包括9对引物， 分别为DD ‑ 02、 DD‑10、 DD‑27、 DD‑77、 DD‑86、 DD‑88、 DD‑98、 DD‑105、 DD‑133， 其序列如下 所示： [0008] 说　明　书 1/9 页 3 CN 114231646 A 3