(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210150996.9 (22)申请日 2022.02.18 (71)申请人 杭州柏熠科技有限公司 地址 310000 浙江省杭州市滨江区长河街 道滨安路68 8号2幢E楼6层6 54室 (72)发明人 毛凌峰　孙凯　尹传林　俞晓平　 (74)专利代理 机构 杭州汇和信专利代理有限公 司 33475 专利代理师 薛文玲 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C40B 50/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库 及检测方法 (57)摘要 本发明提供一种适用于15种植物检疫病毒 的靶向测序建库及检测方法， 设计针对15种植物 检疫病毒的特异引物池， 并将特异性多重反转录 技术与纳米孔技术相结合， 建立针对15种植物检 疫病毒的靶向捕获测序方法， 具备高灵敏度、 高 通量、 低成本的优点， 可实现单次建库测序检测 15种植物检疫病毒的目标， 可解决 目前植物病毒 检疫存在的检测通 量低、 检测目标单一的问题。 权利要求书1页 说明书17页 序列表5页 附图2页 CN 114480740 A 2022.05.13 CN 114480740 A 1.一种适用于15种植物检疫病毒的靶向测序建库方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 提取植物样品RNA， 利用特异性引物池对植物样品RNA进行反转录合成病毒cDNA， 其中 特异性引物池 包括SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.30所示的引物序列； 根据病毒cDNA两端保守序列对不同病毒进行PCR扩增， 得到富集双链DNA； 对富集双链 DNA进行定量和稀释， 进行接 头连接。 2.根据权利要求1所述的适用于15种植物检疫病 毒的靶向测序建库方法， 其特征在于， 在“利用特异性引物池对植物样 品RNA进行反转录合成病毒cDNA ”步骤中， 联用纳米孔测序 试剂盒的S SP引物， 使得每一病毒cDNA的5 ’端加接头。 3.根据权利要求1所述的适用于15种植物检疫病 毒的靶向测序建库方法， 其特征在于， 根据cDNA两端保守序列， 联barcode引物对不同cDNA进行PCR扩增。 4.根据权利要求1所述的适用于15种植物检疫病 毒的靶向测序建库方法， 其特征在于， PCR循环条件为： 9 5℃， 30sec； 9 5℃， 30sec 执行11‑18个循环； 62℃， 15sec 执行11‑18个循环； 65℃， 1min执行11‑18个循环； 65℃， 6min执行2个循环； 并保持在4℃。 5.根据权利要求1所述的适用于15种植物检疫病 毒的靶向测序建库方法， 其特征在于， 15种植物检疫病毒包括： 南芥菜花叶病毒、 菜豆荚斑驳病毒、 可可肿枝病毒、 香石竹环斑病 毒、 玉米褪绿矮缩病毒、 玉米褪绿斑驳病毒、 燕 麦花叶病毒、 马铃薯帚 顶病毒、 马铃薯A病毒、 马铃薯V病毒、 马铃薯黄 矮病毒、 南方菜豆花叶病毒、 甘蔗线 条病毒、 烟草环斑病毒以及小麦 线条花叶病毒。 6.一种适用于15种植物检疫病毒的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 获取待测植物样品； 提取植物样品RNA， 利用特异性引物池对植物样品RNA进行反转录合成病毒cDNA， 其中 特异性引物池 包括SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.30所示的引物序列； 根据病毒cDNA两端保守序列对不同病毒 进行PCR扩增， 得到富 集双链DNA； 对富集双链DNA进行定量和稀释， 进行接 头连接得到核酸样本库； 将核酸样本库上机实时检测， 获取纳米孔测序数据； 分组纳米孔测序数据并和标准病毒数据库比对， 确定植物检疫病毒序列。 7.根据权利要求1所述的适用于15种植物检疫病毒的检测方法， 其特征在于， 15种植物 检疫病毒包括： 南芥菜花叶病毒、 菜豆荚斑驳病毒、 可可肿枝病毒、 香石竹环斑病毒、 玉米褪 绿矮缩病毒、 玉米褪绿斑驳病毒、 燕 麦花叶病毒、 马铃薯帚 顶病毒、 马铃薯A病毒、 马铃薯V病 毒、 马铃薯黄矮病毒、 南方菜豆花叶病毒、 甘蔗线条病毒、 烟草环斑病毒以及小麦线条花叶 病毒。 8.根据权利要求1所述的适用于15种植物检疫病毒的检测方法， 其特征在于， 在 “利用 特异性引物池对植物样品RNA进 行反转录合 成病毒cDNA ”步骤中， 联用纳米孔测序试剂盒的 SSP引物， 使得每一病毒cDNA的5 ’端加接头。 9.根据权利要求1所述的适用于15种植物检疫病 毒的检测方法， 其特征在于， 将富集双 链DNA纯化至满足OD260/280为1.8 ‑2.1及OD260/230为2.2 ‑2.5的条件， 稀释到100ng/ul的 核酸浓度。 10.一种试剂盒， 其特征在于， 包括适用于反转录15种植物检疫病毒的特异性引物池， 其中特异性引物池 包括SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.30所示的引物序列。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480740 A 2适用于15种植物检疫病毒 的靶向测序建库及检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及植物病毒检疫领域， 特别涉及一种适用于15种植物检疫病毒的靶向测 序建库及检测方法。 背景技术 [0002]植物病毒被视为 “植物癌症 ”， 其会导致农作物的低产并威胁人类食品安全， 进而 引发一系列社会问题。 随着我国国际农产品贸易的不断发展， 检疫性植物病毒入侵风险逐 年加大， 严重威胁我国农业生产安全， 因此建立快速检疫性植物病毒检测技术和监测体系 是保障农业安全生产的重要 前提。 目前， 植物病毒的检疫工作已在各港口所,各省市大专院 校， 农科院等单位普遍开展起 来。 [0003]目前检测植物病毒的传统方法包括血清学检测、 电子显微镜观察、 PCR或RT ‑PCR、  芯片杂交等， 但此类检测植物病毒的方法存在许多的弊端， 例如电镜观察容易出现判断不 准确的情况， 核酸扩增技术受限于多重扩增引物的设计， 血清学技术的效率有限， 因此极大 地限制了各类 检测方法在实际工作中的推广和应用。 [0004]在过去的十几年中， 测序技术 的发展迅猛， 测序技术已经从第一代Sanger法测序 到第二代测序技术(Next ‑generation  sequencing,NGS)  为分子生物学领域带来了革命性 的变化。 测序技术也适用于植物病毒的快速检测， 目前主流的基于深度测序的植物病毒检 测主要以NGS技 术为主。 [0005]但是基于NGS测序技术的病毒检测依然面临很多问题， 存在的问题主要体现在以 下几个方案： 1.在设备上NGS测序仪属 于大型仪器， 价格昂贵。 需要在专业的实验室或公司 平台； 2.在实验操作上， 测序文库准备复杂且步骤繁琐， 需要专业的实验操作人员。 3.在测 序流程和检测周期上， NGS实验操作和测序周期为2 ‑3天。 4.在测序数据质控和数据分析上， 由于NGS依赖于P CR扩增， 因此具有一定的测序偏好性， 导致基因组覆盖不全而且由于NGS测 序长不1Kb， 因此病毒基因组需要组装， 在一定程度上结果极度 依赖软件和算法的优化和提 高。 [0006]纳米孔测序技术是基于核酸分子通过纳米孔时电势差变化而进行碱基检测的单 分子测序技术。 与已有测序技术不同的是， 纳米孔测序技术没有DNA合成这一步骤， 是目前 唯一可以对核酸分子直接进行测序的技术。 同时纳米孔测序还兼具超长读长、 便携且可实 时测序、 高通量多平台等其他测序平台不具有的优势。 但是其试剂成本相比较于二代测序 高于5～10倍， 同时由于缺少针对植物检疫病毒生物信息分析流程导致该技术在实际中很 难普及， 需要进一步改进。 此外， 我国植物检疫病毒基因组类型多样， 有的为RNA病毒、 有的 为DNA病毒， 而RNA病毒又包括含有PolyA 尾巴和不含PolyA 尾巴的RNA病毒。 目前针对上述不 同类型的植物病毒， 通常需要采用不同的建库方案， 增加了单次同时检测不同类型植物病 毒的成本和难度。说　明　书 1/17 页 3 CN 114480740 A 3