(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210153659.5 (22)申请日 2022.02.19 (71)申请人 南京鼓楼医院 地址 江苏省南京市 鼓楼区中山路321号 (72)发明人 李智洋　杨平　王延博　沈翰　 (74)专利代理 机构 南京禾祁专利代理事务所 (普通合伙) 32462 专利代理师 黄天天 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) G16B 20/30(2019.01) G16B 25/20(2019.01) (54)发明名称 诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物及其筛 选方法和应用 (57)摘要 本发明公开了诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA 标志物， 所述血清tsRNA标志物为tRF ‑Ala‑AGC‑ 2‑M4。 本发明还另外公开了诊断狼疮性肾炎的血 清tsRNA标志物 的筛选方法和应用， 通过测序分 析， 对LN患者和健康对照组血清样本中差异表达 的tsRNA进行筛选。 本发明提供了一种tsRNA标志 物tRF‑Ala‑AGC‑2‑M4， 其在LN患者血清中高表 达， 并与LN的疾病活动度密切相关， 具有辅助LN 早期诊断和疾病监测的价值， 亦为狼疮性肾炎方 面tsRNA的深入研究奠定了基础； 且检测时取样 简单， 灵敏度高， 特异性强， 有利于规模化临床应 用。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图4页 CN 114752595 A 2022.07.15 CN 114752595 A 1.诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物， 其特征在于， 所述血清tsRNA标志物为tRF ‑ Ala‑AGC‑2‑M4， 其序列为UC CCCGGCACCUCCACCA。 2.诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的筛选方法， 其特征在于， 所述方法包括以下步 骤： 1)对LN组和HC组血清标本进行测序， 对测序数据进行均一化处理。 选出差异倍数大于 10， 即Fold  change>10， 并且P值小于0.05的tsRNA； 删除重复、 错配、 表达丰度过低的tsRNA， 进行聚类、 G O和KEGG分析， 最终选出10个显著高表达的tsRNA； 2)对选出的10个高表达的tsRNA用逆转录荧光定量聚合酶链式反应RT ‑qPCR进行标本 测试， 再对测试 得到的tsRNA通过RT ‑qPCR进一 步标本验证， 即得到目标tsRNA。 3)采用受试者工作特征曲线ROC分析目标tsRNA的诊断效能， 进一步将目标tsRNA与临 床评价LN的疾病活动度指标SLEDAI ‑2000关联分析， 鉴定其诊断能力。 3.根据权利要求2所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的筛选方法， 其特征在 于， 标本数为n， LN血清标本数为130， 其中， 所述步骤1)中LN组n＝33； 所述步骤2)中标本测 试， Training， n＝24， 标本验证Val idation， n＝73； 所述 步骤1)中H C组， n＝23。 4.根据权利要求2所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的筛选方法， 其特征在 于， 所述步骤1)采用Illumina  NextSeq 500进行测序， 并采用高通量基因表达数据库进行 分析。 5.根据权利要求2所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的筛选方法， 其特征在 于， 所述步骤2)RT ‑qPCR检测工具为Bi o‑Rad CFX96 Deep Well Real Time System。 6.根据权利要求2所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的筛选方法， 其特征在 于， 所述筛选方法使用的数据分析软件为Graphpad  Prism 8.0、 Microsoft  office、 SPSS24.0。 7.诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的应用， 其特征在于， 应用血清tsRNA标志物制 备狼疮性肾炎诊断试剂盒， 所述诊断试剂盒包括tsRNA标志物tRF ‑Ala‑AGC‑2‑M4的特异性 探针。 8.根据权利要求7所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的应用， 其特征在于， 所 述诊断试剂盒还 包括逆转录试剂和/或qPCR定量试剂。 9.根据权利要求8所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的应用， 其特征在于， 所 述逆转录试剂还包括逆转录引物， 序列为GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATAC GACTGGTGG。 10.根据权利要求8所述的诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的应用， 其特征在于， 所 述qPCR定量试剂还包括qPCR引物， 序列分别为F ： CGCGTCCCCGGCACCT； R ： AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752595 A 2诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物及其筛选方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学技术领域， 具体涉及诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物 及其筛选方法和应用。 背景技术 [0002]肾脏是系统性红斑狼疮(systemic  lupus erythematosus， SLE)受累最严重的器 官之一。 大多数SLE患者在确诊5年内出现狼疮肾炎(LN)。 10％的LN患者发展为终末期肾病 (End stage renal disease， ESRD)， 极大地加重了SLE患者的病情。 显然， LN的早期诊断和 及时治疗 对预防疾病进 展至关重要。 [0003]LN的临床诊断目前仍采用24h尿蛋白定量、 血清肌酐、 尿蛋白/肌酐比、 尿沉渣镜 检、 肾小球滤过率、 抗双链DNA 抗体、 补体等多项指标联合评估， 然而这些指标的灵敏度和特 异性不够， 带来了明显的临床滞后性。 当前， 肾活检是诊断LN的金标准。 但该检查为侵入性 检查， 不易多次重复检查， 并且出血风险高的患者也不宜检查。 24h尿蛋白定量是临床常用 检查方法， 但也有一些不足。 例如尿液收集时间不准确， 留存期间尿液易丢失， 患者依从性 差等。 因此， 寻找新的灵敏度和特异性更高的标志物是解决LN患者早期诊断并及时治疗的 有效途径。 [0004]tsRNA是产生于成熟tRNA或其前体的一种非编 码RNA分子， 其片段长度为18 ‑40nt。 tsRNA具有来自tRNA的二级结构和表面修饰， 其含有多种信息并在多种组织中稳定存在。 tsRNA具有广泛的生物学作用， 包括细胞和组织的应激 反应、 蛋白质翻译调控、 肿瘤发生、 干 细胞生物学、 核糖体生物合成、 转座子调控、 表观遗传调控、 凋亡抑制、 免疫反应等方面。 其 表达类型、 丰度及修饰与性别、 种族、 组织细胞类型和疾病状态等相关。 然而， 在自身免疫性 疾病领域， 还没有用于早期诊断的tsRNA标志物， 尤其是狼疮性 肾炎方面的研究尚未见报 道。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明期望提供诊 断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物及其筛选方法和 应用， 血清tsRNA的异常表达与LN的疾病活动程度密切相关， 可以作为LN早期诊断或疾病监 测的标志物； 且为本发 明方法筛选证实的可以用于LN诊断的tsRNA标志物， 为LN标志物的研 究提供了新的思路。 [0006]为达到上述目的， 本发明的技 术方案是这样实现的： [0007]诊断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物， 所述血清tsRNA标志物为tRF ‑Ala‑AGC‑2‑ M4， 其序列为UC CCCGGCACCUCCACCA。 [0008]这里， tRF ‑Ala‑AGC‑2‑M4为首个被证实的可用于诊断LN的tsRNA标志物， 为狼疮性 肾炎方面tsRNA的深入研究奠定 了基础。 [0009]本发明还提供诊 断狼疮性肾炎的血清tsRNA标志物的筛选方法， 所述方法包括以 下步骤：说　明　书 1/5 页 3 CN 114752595 A 3