(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210153962.5 (22)申请日 2022.02.20 (71)申请人 滁州职业 技术学院 地址 239000 安徽省滁州市丰乐大道 2188 号 (72)发明人 姜自红　贾雪晴　刘文干　孙钦花　 (74)专利代理 机构 江苏苏源律师事务所 3258 8 专利代理师 刘林 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 一种同时检测CVB和TAV的RT-RPA双重荧光 检测方法 (57)摘要 本发明属于生物检测技术领域， 具体为一种 同时检测CVB和TAV的RT ‑RPA双重荧光检测方法， 该同时检测CVB和TAV的RT ‑RPA双重荧光检测方 法的具体步骤如下： 引物与探针的设计： 从NCBI 数据库中分别下载CVB和TAV病毒基因组序列， 用 生物学软件进行比对， 选 择CVB和TAV外壳蛋白基 因的保守区域作为靶基因设计引物； 定量标准品 的制备与定值研究， 引物组合的筛选。 构建的CVB 和TAV双重实时荧光RT ‑RPA检测体系除了 具有高 灵敏度外， 其对高浓度和低浓度的核酸检测重 现 性好； 对不同菊花和植物病毒检测特异性强； 整 个检测时间仅需15min， 为菊花病毒的检测和监 测提供技 术支持。 权利要求书1页 说明书9页 附图8页 CN 115011732 A 2022.09.06 CN 115011732 A 1.一种同时检测CVB和TAV的RT ‑RPA双重荧光检测方法， 其特征在于， 该同时检测CVB和 TAV的RT‑RPA双重荧 光检测方法的具体步骤如下： 引物与探针的设计： 从NCBI数据库中分别下载CVB和TAV病毒基因组序列， 用生物学软件进行比对， 选择CVB 和TAV外壳蛋白基因的保守区域作为靶基因设计引物， 利用Twist引物和Twist  exo‑探针设 计原则分别设计4组RIA扩增引物和探针， 对设计的4组引物在NCBI中进行Blast， 比对结果 均为相应的病毒； 定量标准品的制备与定值研究： 选择CVB和TAV外壳蛋白基因的保守区体外合成含有pGEM ‑T载体的2种病毒目的基因片 段的质粒， CVB和TAV的目的基因片段大小分别为304bp和196bp， 均采用EcoRI酶切下含有T7 启动子的目的片段， 再经SacI酶切线性化， 酶切产物纯化回收后用T7  High Efficiency   Transcription  Kit体外反转录成RNA， 根据测定的浓度换算成拷贝数， 采用RNA稀释液10倍 梯度稀释成RNA标准品， 浓度分别为： 1.0 ×108拷贝/mL、 1.0 ×107拷贝/mL、 1.0 ×106拷贝/ mL、 1.0×105拷贝/mL、 1.0 ×104拷贝/mL、 1.0 ×103拷贝/mL， ‑80℃储存备用； 引物组合的筛 选： 采用RT‑RPA扩增试剂结合上述设计的CVB和TAV  RIA扩增引物进行引物探针的筛选， 50 μL反应体系中10 ×RIA Reaction  Buffer 5.0 μL， RIA  Enzyme Mix 10.0 μL， RIA  Reaction   CoreMix13.5μL， 40U/μL  RNA Inhibitor  0.5μL， 200U/μL  Multiscript  I Reverse  Transcriptase 1.0 μL， 25mM dNTPs 3.6 μL， 加入DEPC 水补至46.5 μL， 混匀后置于冰上， 分别 以中浓度1.0 ×106拷贝/mL和低浓度1.0 ×104拷贝/mL的CVB和TAV  RNA参考品为模板， 模板 量2 μL， 再加入浓度为280mmol/L的MgOAc 溶液2.5 μL， 对上述设计的4组CVB和TAV引物探针组 合分别进行筛 选。 2.根据权利要求1所述的一种同时检测CVB和TAV的RT ‑RPA双重荧光检测方法， 其特征 在于： 所述引物组合的筛 选步骤中引物浓度为： 20 0nmol/L、 400nmol/L或600nmol/L。 3.根据权利要求1所述的一种同时检测CVB和TAV的RT ‑RPA双重荧光检测方法， 其特征 在于： 所述引物组合的筛 选步骤中探针浓度为： 10 0nmol/L、 120nmo l/L或150nmol/L。 4.根据权利要求1所述的一种同时检测CVB和TAV的RT ‑RPA双重荧光检测方法， 其特征 在于： 所述引物组合的筛 选步骤中反应温度为： 37℃、 39℃或42℃。 5.根据权利要求1所述的一种同时检测CVB和TAV的RT ‑RPA双重荧光检测方法， 其特征 在于： 所述引物组合的筛 选步骤中反应时间为： 5mi n、 10min或15min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011732 A 2一种同时检测CVB和TAV的RT ‑RPA双重荧光检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测 技术领域， 具体为一种同时检测CVB和TAV的RT ‑RPA 双重荧 光检测方法。 背景技术 [0002]菊花是我国的传统名花， 具有重要的经济和文化价值。 菊花在栽培中往往会同时 受到几种病原体的复合感染， 由病毒病引起的种质退化、 质量下降， 已成为菊花生产的一个 突出问题。 [0003]目前已经报道的菊花病毒有20多种， 中国报道的有8种， 其中菊花B病毒 (chrysanthemum  virus B,CVB)和番茄不孕病毒(tomato  aspermy virus, TAV)是危害菊 花的2种主要优势病毒。 菊花B病毒为单股正链RNA病毒， 属 于香石竹潜隐病毒属， 其病毒粒 体近似直线状， 大小685nm ×12nm， 病毒基因组3426nt， 具有6个开放阅读框,是危害菊花的 主要病毒之一。 感病株形成 明显的花叶症状或坏死斑， 严重的产生褐色枯斑。 除了危害菊花 外， 菊花B  病毒还能侵染矮牵牛、 烟草、 百日草、 野菊、 金盏菊、 翠菊、 茼蒿、 蜡菊以及罗娜菊 等植物。 番茄不孕病毒属于黄瓜花叶病毒属， 其病毒 粒子为球形， 直径约30nm。 基因组由3条 正单链RNA组成， 可表达产生5个蛋白产物。 TAV  的寄主范围广， 人工接种可侵染24科100多 种植物， 在世界种 植菊花的国家均有分布。 CVB和TAV两种病毒在中国云南、 中国福建、 中国 北京、 中国台湾和浙江等地都有分布， 常复合感染， 感染率为20.9％， 目前对植物病毒的分 子检测技术多为PCR， RT ‑RPA在植物病毒检测中的应用比较少见， 尚未见到利用RT ‑RPA技术 同时进行CVB和TAV的双重检测方式， 因此， 十分有必要建立一种CVB和  TAV的快速有效、 准 确分型的检测方法。 发明内容 [0004]本发明的目的在 于提供一种同时检测CVB和TAV的RT ‑RPA双重荧光检测方法， 以解 决上述背景技 术中提出的问题。 [0005]为实现上述目的， 本发明提供如下技术方案： 一种同时检测CVB和TAV  的RT‑RPA双 重荧光检测方法， 该同时检测CVB和TA V的RT‑RPA双重荧 光检测方法的具体步骤如下： [0006]引物与探针的设计： [0007]从NCBI数据库中分别下载CVB和TAV病毒基因组序列， 用生物学软件进行比对， 选 择CVB和TAV外壳蛋白基因的保守区域作为靶基因设计引物， 利用Twist引物和Twist  exo‑ 探针设计原则分别设计4组RIA扩增引物和探针， 对设计的4组引物在NCBI中进行Blast， 比 对结果均为相应的病毒； [0008]定量标准品的制备与定值研究： [0009]选择CVB和TAV外壳蛋白基因的保守区体外合成含有pGEM ‑T载体的2种病毒目的基 因片段的质粒， CVB和TAV的目的基因片段大小分别为304bp和  196bp， 均采用EcoRI酶切下 含有T7启动子的目的片段， 再经SacI酶切线性化， 酶切产物纯化回收后用T7  High 说　明　书 1/9 页 3 CN 115011732 A 3