(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221015909 2.2 (22)申请日 2022.02.21 (71)申请人 中国科学院地球化学研究所 地址 550081 贵州省贵阳市观山湖区林城 西路99号 (72)发明人 曹昊睿　张华　冉芳　徐鹏奇　 汤琳　毛康　晏智　钟理　 凯文·托马斯　 (74)专利代理 机构 北京睿阳联合知识产权代理 有限公司 1 1758 专利代理师 景鹏　张颖 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12N 15/113(2010.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基于LAMP和CRISPR的病毒检测试剂盒和方 法 (57)摘要 公开了基于LAMP和CRISPR的病毒检测试剂 盒和方法。 具体公开了一种用于特异性检测样本 中的靶病毒的引物， 其特征在于， 所述引物包括 两种或两种以上的引物组， 所述两种或两种以上 的引物组分别特异性靶向所述病毒的不同的基 因或者同一基因的不同区域， 且 所述两种两种或 两种以上的引物组具有不同的检出限。 还公开了 使用该引物的试剂盒和检测病毒的方法。 权利要求书2页 说明书11页 序列表8页 附图3页 CN 114457195 A 2022.05.10 CN 114457195 A 1.一种用于特异性检测样本中的靶病毒的引物， 其特征在于， 所述引物包括两种或两 种以上的引物组， 所述两种或两种以上的引物组分别特异性靶向所述病毒的不同的基因或 者同一基因的不同区域， 且所述两种两种或两种以上的引物组具有不同的检出限。 2.根据权利要求1所述的引物， 其特征在于， 所述引物用于环介导恒温扩增反应， 优选 用于实时环介导恒温扩增反应。 3.根据权利要求1或2所述的引物， 其特征在于， 所述引物组各自包括上游外部引物、 下 游外部引物、 上游内部引物和/或下游内部引物， 优选地， 所述引物组各自包括上游外部引物、 下游外部引物、 上游内部引物、 下游内部 引物、 上游 环部引物和/或下游 环部引物。 4.根据权利要求1至3中任一项所述的引物， 其特征在于， 所述靶病毒为严重急性呼吸 系统综合征冠状病毒( SARS‑CoV‑2)， 优选选自SARS ‑CoV‑2的Wuhan ‑Hu‑1/2019、 Alpha、 Beta、 Gam ma、 Delta和O micron毒株中的一种或多种。 5.根据权利要求4所述的引物， 其特征在于， 所述引物包括第一引物组、 第二引物和第 三引物组中的两种或三种， 其中所述第一引物组、 所述第二引物和所述第三引物组分别特 异性靶向所述SARS ‑CoV‑2的S基因、 N基因和E基因， 优选地， 所述第一引物组包括： 第一上游外 部引物， 具有如SEQ  ID NO.:13所示的序列； 第一下游外 部引物， 具有如SEQ  ID NO.:14所示的序列； 第一上游内部引物， 具有如SEQ  ID NO.:15所示的序列； 和 第一下游内部引物， 具有如SEQ  ID NO.:16所示的序列， 优选地， 所述第二引物组包括： 第二上游外 部引物， 具有如SEQ  ID NO.:1所示的序列； 第二下游外 部引物， 具有如SEQ  ID NO.:2所示的序列； 第二上游内部引物， 具有如SEQ  ID NO.:4所示的序列； 和 第二下游内部引物， 具有如SEQ  ID NO.:3所示的序列， 优选地， 所述第三引物组包括： 第三上游外 部引物， 具有如SEQ  ID NO.:7所示的序列； 第三下游外 部引物， 具有如SEQ  ID NO.:8所示的序列； 第三上游内部引物， 具有如SEQ  ID NO.:10所示的序列； 和 第三下游内部引物， 具有如SEQ  ID NO.:9所示的序列。 6.根据权利要求5所述的引物， 其特 征在于， 所述第一引物组还包括： 第一上游环部引物， 具有如SEQ  ID NO.:17所示的序列； 和， 第 一下游环部引物， 具有如SEQ  ID NO.:18所示的序列， 所述第二引物组还包括： 第二上游环部引物， 具有如SEQ  ID NO.:5所示的序列； 和， 第 二下游环部引物， 具有如SEQ  ID NO.:6所示的序列， 所述第三引物组还包括： 第三上游环部引物， 具有如SEQ  ID NO.:11所示的序列； 和， 第 三下游环部引物， 具有如SEQ  ID NO.:12所示的序列。 7.一种检测样本中的病毒的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括如权利要求1至6中 任一项所述的引物。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114457195 A 28.根据权利要求7所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括可编程的核酸酶， 以 及两种或两种以上的gRNA， 优选地， 所述可编程的核酸酶选自Cas12、 Cas13或Cas14核酸酶， 更优选地， 所述可编程的核酸酶Cas12核酸酶。 9.根据权利要求7或8所述的试剂盒， 其特征在于， 所述两种或两种以上的gRNA包括第 一gRNA、 第二gRNA和第三gRNA中的两种或三种， 其中所述第一gRNA、 所述第二gRNA和所述第 三gRNA分别特异性靶向SARS ‑CoV‑2的S、 N和E基因， 优选地， 所述第一gRNA具有如SEQ  ID NO.:21所示的序列； 优选地， 所述第二gRNA具有如SEQ  ID NO.:19所示的序列； 优选地， 所述第三gRNA具有如SEQ  ID NO.:20所示的序列。 10.根据权利要求7至9中任一项所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒还包括报告探 针， 所述报告探针为单链核酸序列； 优选地， 所述报告探针包括分别位于所述单链核酸序列的两末端的检测基团和猝灭基 团， 其中， 所述检测基团选自荧光素、 6 ‑荧光素、 IRDYE  700、 TYE 665、 Alexa  Fluor或ATTO   TM633， 所述猝灭基团选自I owa Black RQ、 Iowa Black FQ或Black  Hole猝灭剂， 优选地， 所述报告探针包括 生物素。 11.根据权利要求10所述的试剂盒， 其特征在于， 所述报告探针包括序列5 ’ ‑(6‑FAM)‑ TTATT‑(BHQ1)‑3’， 或者5’ ‑(6‑FAM)‑TTATTATT‑(Bio)‑3’。 12.根据权利要求7至11中任一项所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括纸微 流控装置， 所述 纸微流控装置包括 纸芯片和检测板 。 13.一种半定量检测样本中的靶病毒的方法， 其特 征在于， 所述方法包括： 将权利要求1至6中任一项所述的两种或两种以上的引物组， 分别与所述样本孵育， 进 行环介导恒温扩增反应， 得到相应的反应产 物； 在所述反应产 物中， 分别添加可编程的核酸 酶与gRNA复合物和报告探针进 行孵育， 得到检测产 物， 其中， 当在一个检测产 物中检测到信 号， 则判断所述样本中含有对应于所使用的引物组的检出限的病毒浓度。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114457195 A 3