(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210156886.3 (22)申请日 2022.02.21 (71)申请人 华南农业大 学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人 亓文宝　简伟俊　朱君海　陈画菡　 张桂红　廖明　黄一凡　高琦　 高飞　 (74)专利代理 机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 温可睿 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 非洲猪瘟病毒的双通道数字PCR检测试剂盒 及方法 (57)摘要 本发明涉及病毒检测领域， 尤其涉及非洲猪 瘟病毒的双通道数字PCR检测试剂盒及方法。 本 发明提供了非洲猪瘟病毒的双通道微滴数字PCR 检测试剂盒及方法， 可以检测到多种不同类型的 毒株， 并鉴别其是否为EP402R缺失株。 此外， 本发 明提供的产品具有良好的特异性和灵敏度： 在几 种常见猪病病毒中仅扩增非洲猪瘟病毒、 对 pMD18T‑EP402R和pMD18T ‑B646L质粒的最低检测 限分别低至0.43copies/μL和2.6copies/μL。 因此本发明有潜力准确检测非洲猪瘟病毒的隐 性感染， 可以应用于临床和生产中该猪瘟病毒特 别是EP402R基因缺失株快速 检测。 权利要求书1页 说明书11页 序列表2页 附图8页 CN 114395643 A 2022.04.26 CN 114395643 A 1.非洲猪瘟病毒EP402R基因的检测引物和探针， 其特 征在于， 包括： EP402R基因上游引物， 其核酸序列如SEQ  ID NO:1所示； EP402R基因下游引物， 其核酸序列如SEQ  ID NO:2所示； EP402R基因探针， 其核酸序列如SEQ  ID NO:3所示。 2.根据权利要求1所述的EP402R基因探针， 其特征在于， 5'端标记荧光报告基团HEX， 3' 端标记荧 光淬灭基团BHQ1。 3.非洲猪瘟病毒B646L基因的检测引物和探针， 其特 征在于， 包括： B646L基因上游引物， 其核酸序列如SEQ  ID NO:4所示； B646L基因下游引物， 其核酸序列如SEQ  ID NO:5所示； B646L基因 因探针， 其核酸序列如SEQ  ID NO:6所示。 4.根据权利要求3所述的B646L基因探针， 其特征在于， 5'端标记荧光报告基团FAM， 3' 端标记荧 光淬灭基团MGB。 5.非洲猪瘟病毒野生型和EP402R缺失型的数字PCR检测试剂盒， 其特征在于， 包括权利 要求1～4所述的引物和探针。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 包括： 含有非洲猪瘟病毒EP402R基因序列的质粒、 含有非洲猪瘟病毒B646L基因序列的质粒。 7.非诊断目的的非洲 猪瘟病毒野生型和EP402 R缺失型数字PCR检测方法， 其特征在于， 包括用权利要求1～4所述的引物和探针对样品进行检测。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述样品来自猪的污染物， 包括饲 料、 水、 猪圈的土壤。 9.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 检测的扩增 温度为50℃～53.9℃， 检 测的荧光通道为HEX和FAM。 10.根据权利要求7 所述的检测方法， 其特 征在于， 检测的结果判断标准 为： FAM通道无荧 光信号,则非洲猪瘟病毒阴性； FAM通道和H EX通道都有荧 光信号， 则非洲猪瘟病毒阳性； FAM通道有荧 光信号， 但H EX通道无荧 光信号， 则非洲猪瘟病毒EP402R缺失株阳性。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114395643 A 2非洲猪瘟病毒 的双通道数字PCR检测试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及病毒检测领域， 尤其涉及非洲猪瘟病毒的双通道数字PCR检测试剂盒 及方法。 背景技术 [0002]非洲猪瘟(African  Swine Fever， ASF)是一种病毒性出血病， 其病原为非洲猪瘟 病毒(Afric an Swine Fever Virus， ASFV)， 在家猪和欧亚野猪中具有极高的致死率。 尽管 其宿主范围有限， 且不能感染人， 但该病造成的经济损失和社会影响巨大， 自2018年传 入中 国以来， 已对中国生猪养殖行业造成毁灭性的打击。 该病容易通过感染猪的污染物、 胎儿、 粪便、 病料组织， 以及污染的饲料和饮水等以直接接触的方式传播， 容易形成大范围的传播 链， 除此之外， 节肢动物(软蜱)、 鼠、 蚊 蝇等也能携带非洲猪瘟病毒并造成传播。 [0003]早期在中国流行的非洲猪瘟病毒一般为野生毒株， 其无明显 的基因缺失现象， 但 是随着病毒在动物体内不断繁殖与扩散、 病毒在各个疫区之间的不断传播， 特别是疑似非 法疫苗的擅自使用， 目前已经出现了部分基因缺失的毒株。 这些毒株大多缺失与病毒部分 毒力相关的基因片段， 如EP402R基因(CD2v蛋白基因)、 MGF ‑505‑3R基因等， 其中， 以缺失 EP402R基因居多。 这些基因缺 失毒株在猪体内的毒力变弱， 病毒滴度变低， 临床上常呈隐性 感染。 上述的野生型毒株和基因缺 失毒株长期存在并不断在排毒， 造成新的非洲猪瘟疫情， 不利于非洲猪瘟病毒精准防控和净化。 因此， 检测鉴别非洲猪瘟病毒的野生毒株和基因缺 失毒株的意 义重大。 [0004]目前， 临床和生产中广 泛使用的是荧光定量PCR检测方法， 随着非洲猪瘟病毒隐性 感染的出现和传播， 荧光定量P CR检测非洲猪瘟病毒的灵敏度受到挑战。 曾有专利公开了一 种非洲猪瘟病毒微滴式数字P CR检测方法及应用， 该发明自主设计并合 成引物、 探针与重组 质粒， 采用微滴式数字PCR反应获得定性或定量的检测结果。 该发明相较于荧光定量PCR等 现有技术具有较好的灵敏度、 特异性、 准确性， 能有效避免假阴性和假阳性结果的出现， 但 该方法基于 两段保守序列VP72和K20 5R， 无法鉴别检测野毒株与基因缺失毒株。 [0005]因此， 有必要研发 能快速检测鉴别非洲猪瘟病毒基因缺失株尤其是EP 402R基因缺 失株的产品。 发明内容 [0006]有鉴于此， 本发明要解决的技术问题在于提供检测非洲猪瘟病毒的野生株、 EP402R基因缺失株的双通道数字PCR的产品和方法。 [0007]本发明提供了非洲猪瘟病毒EP402R基因的检测引物和探针， 包括： [0008]EP402R基因上游引物， 其核酸序列如SEQ  ID NO:1所示； [0009]EP402R基因下游引物， 其核酸序列如SEQ  ID NO:2所示； [0010]EP402R基因探针， 其核酸序列如SEQ  ID NO:3所示。 [0011]所述的EP402R基因探针， 其5'端标记荧光报告基团HEX， 3'端标记荧光淬灭基团说　明　书 1/11 页 3 CN 114395643 A 3