(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210157701.0 (22)申请日 2022.02.21 (71)申请人 湖北省烟草科学研究院 地址 430000 湖北省武汉市硚口区宝丰二 路6号香溢大酒店 (72)发明人 曹景林　程君奇　李亚培　吴成林　 孙艺文　张俊杰　 (74)专利代理 机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 专利代理师 祝蓉蓉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于烟草抗青枯病的相斥相分子标记、 引物 及其筛选方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于烟草抗青枯病的相 斥相分子标记、 引物及其筛选方法和应用， 属于 抗青枯病烟草的筛选技术领域。 本发 明针对烟草 抗青枯病提供了两种的相斥相分子标记， 分别为 烟草基因43 70和烟草基因3 7372的相斥相分子标 记； 并针对这两个分子标记提供了相应的UTR引 物对和SSR引物对。 本发明还提供了检测或筛选 抗青枯病的烟草育种材料或 品种的方法， 利用上 述引物对待测烟草品种的基因进行PCR扩增， 利 用电泳分离技术检测标记， 根据是否显示条带， 判断待测烟草育种材料或品种是否抗青枯病。 上 述方法显著提高了抗青枯病烟草品种育种的准 确性和鉴别效率， 克服了性状表型鉴定困难和常 规分子标记对数量 性状选择时的低效问题。 权利要求书2页 说明书8页 序列表5页 附图3页 CN 114540531 A 2022.05.27 CN 114540531 A 1.用于烟草抗青枯病的相斥相分子标记， 其特征在于， 为烟草基因4370的相斥相分子 标记， 或烟草基因37372的相斥相分子标记； 烟草基因4370 的相斥相分子标记引 物扩增的核苷酸序列如序列表SEQ  ID NO.1所示； 烟草基因37372的相斥相分子标记引物扩增的核苷酸序列如序列表SEQ  ID NO.2所示。 2.一种用于扩增权利要求1所述的相斥相分子标记的引物对， 其特征在于， 扩增烟草基 因4370的相斥相分子标记的UTR引物对中， 正向引物和反向引物的长度为18 ‑25bp， GC含量 30‑60％， 复性温度为5 6‑62℃， PCR产物的长度为10 0‑350bp； 扩增烟草基因37372的相斥相分子标记的SSR引物对中， 正向引物和反向引物的长度为 18‑25bp， GC含量 为30‑60％， 复性温度为5 6‑62℃， PCR产物长度为10 0‑350bp。 3.根据权利要求2所述的相斥相分子标记的引物对， 其特征在于， 扩增烟草基因4370的 相斥相分子标记的UTR引物对中， 正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示， 反向引物的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 扩增烟草基因37372的相斥相分子标记的SSR引 物对中， 正向引物的核苷酸序列如SEQ   ID NO.5所示， 反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示。 4.一种检测或筛选抗青枯病的烟草育种材料或品种的方法， 其特征在于， 针对权利要 求1的相斥相分子标记， 或使用权利要求2所述的相斥相分子标记的引物对， 进行抗青枯病 的烟草育种材 料或品种的检测或筛 选。 5.根据权利要求4所述的检测或筛选抗青枯病的烟草育种材料或品种的方法， 其特征 在于， 包括以下步骤： S1、 提取并以待测的烟草育种材料或品种的DNA为扩增模板， 使用扩增烟草基因37372 的相斥相分子标记的引物对， 或扩增烟草基因4370的相斥相分子标记的引物对进行PCR扩 增； S2、 利用电泳分离技术读取差异条带； 如果电泳凝胶上显示条带， 则待测烟草育种材料 或品种不 抗青枯病； 若不显示条 带， 则待测烟草育种材 料或品种抗青枯病。 6.根据权利要求5所述的检测或筛选抗青枯病的烟草育种材料或品种的方法， 其特征 在于， 步骤S1中， PCR扩增反应体系为： 16.1 μL的ddH2O、 2 μL的10 ×buffer、 0.3 μL的dNTP、 0.2 μL的正向引物、 0.2 μL的反向引物、 0.2 μL的Easytaq  PCR、 1 μL的cDNA， 反应 体积为20 μL； 反应条件为： 94℃预变性5min， 94℃ 30s， 退火温度为56℃ 30s， 72℃ 30s， 34个循环， 72℃ 延伸7min。 7.根据权利要求5所述的检测或筛选抗青枯病的烟草育种材料或品种的方法， 其特征 在于， 步骤S2中， 电泳分离技 术采用全自动毛细管电泳系统或凝胶电泳 。 8.根据权利要求7所述的检测或筛选抗青枯病的烟草育种材料或品种的方法， 其特征 在于， 步骤S2中， 电泳 分离技术采用全自动毛细管电泳系统时， 则按系统的说明书要求进 行 操作， 采用型号为800和900的FA  dsDNA Gel， 选择系统携带的Gel  Primer Ouly电泳程序进 行电泳， 电泳时间6 0min， 电泳结束后采用系统自带 软件分析电泳结果并读取差异条 带。 9.根据权利要求7所述的检测或筛选抗青枯病的烟草育种材料或品种的方法， 其特征 在于， 步骤S2中， 电泳分离技术采用凝胶电泳时， 采用银染技术显色并读取差异条带， 银染 技术的试剂包括固定液、 染色液和显色液； 所述固定液是将冰醋酸加至ddH2O中制成， 且冰醋酸浓度为10％； 所述染色液是将AgNO3权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114540531 A 2和甲醛加至ddH2O中制成， 且AgNO3浓度为1g/L， 甲醛浓度为0.056％； 所述显色液是将 Na2CO3、 甲醛、 Na2S2O3·5H2O加至ddH2O中制成， 且Na2CO3浓度为30g/L， 甲醛浓度为0.056％， Na2S2O3浓度为2mg/L。 10.根据权利要求9所述的检测或筛选抗青枯病的烟草育种材料或品种的方法， 其特征 在于， 步骤S2中， 银染技 术的染色过程 为： S21、 将电泳凝胶放置于固定液中， 滴入二甲苯青指示剂， 振荡30min， 直至溶液变无色； 取出电泳凝胶用ddH2O漂洗， 沥干， 重复处 理2次； S22、 将电泳 凝胶放入染色液中， 振荡3 0min； 取出电泳凝胶用ddH2O漂洗 5‑10s； S23、 将电泳凝胶放入显色液中， 迅速摇动10s， 倒掉显色液； 再次倒入显色液继续显色 直至显色； 显色后取出电泳凝胶放入固定液终止显色， 轻轻摇动5min后， 用自来水冲洗干 净。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114540531 A 3