(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210156325.3 (22)申请日 2022.02.21 (71)申请人 聊城大学 地址 252059 山东省聊城市湖南路一 号 (72)发明人 袁修华　孙群　包春江　李霞　 薛庆旺　 (74)专利代理 机构 成都方圆聿联专利代理事务 所(普通合伙) 51241 专利代理师 邓永红 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/6825(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于信号扩增的自组装免标记检测HBV的方 法和试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种基于信号扩增的自组装 免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒DNA 的方法和试剂盒， (1)将待检测的HB V核酸样本进 行RCA扩增； (2)将步骤(1)的扩增产物与Cas12a、 crRNA和生物素标记的ssDNA混合， 孵育反应后加 热使Cas12a失活； (3)将S1加入 步骤(2)处理后的 反应液中孵育杂交， 然后加入S2进孵育杂交， 完 成后加入链霉亲和素磁球振荡孵育， 孵育完成后 将磁球分离， 再加入荧光染料SYBR  Green I孵 育， 孵育完成后使用荧光分光光度计测定荧光强 度。 因多重信号放大所带来的强大的信号输出性 能， 所设计提出的方法具有较高的灵敏度和较宽 线性范围等优点。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图5页 CN 114438262 A 2022.05.06 CN 114438262 A 1.非诊断目的的基于信号扩增的自组装免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒 DNA的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)提取待检测的HBV核酸样本DNA， 与P ‑DNA环化后进行RCA扩增； (2)将步骤(1)的扩增产物与Cas12a、 crRNA和生物素标记的ssDNA混合， 孵育反应后加 热使Cas12a失活； (3)将S1加入步骤(2)处理后的反应液中进行孵育杂 交， 然后加入S2进行孵育杂 交， 完 成后加入链霉亲和素磁球振荡孵育， 孵育完成后将磁球分离， 再加入荧光染料SYBR  Green  I孵育， 孵育完成后使用荧 光分光光度计测定荧 光强度； 其中， ssDNA的核苷酸序列为如SEQ  ID No.1所示， S1的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所 示， S2的核苷酸序列如SEQ  ID No.3所示， P‑DNA的核苷酸序列如SEQ  ID No.4所示， crRNA的 核苷酸序列如SEQ  ID No.5所示。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征子在于， 生物素标记的ssDNA、 S1、 S2的浓度比例 为1:4:4。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)RCA扩增反应 将5 μL待检测核酸样本、 5 μL  2 μM的P‑DNA混匀90℃孵育5min后冷却至室温， 然后， 加入1 μL 40U/ μL T4 DNA连接酶和1.5 μL  10×T4 DNA连接酶缓冲溶液h和2.5 μL无酶水混合均匀， 在室温下孵育2 h， 时间结束之后， 1 μL  2U/ μL phi29 DNA聚合酶、 2 μL  10mM dNTP和1.5 μL  10 ×phi29 DNA聚合酶缓冲溶液在30℃孵育1.5h， 反应结束后将反应混合物加热至65℃   10min使phi29 DNA聚合酶和T4  DNA连接酶失活； (2)Cas12a系统的剪切反应 步骤(1)反应完 成后， 与1 μL  500nM Cas12a、 1 μL  1.5 μM crRNA、 0.5 μL  1 μM ssDNA、 2.5 μ L 10×Cas12a缓冲溶液， 混合均匀， 在37℃下孵育1.5h， 反应结束后将反应 混合物加热至65 ℃ 10min使Cas12a失活； (3)免标记自组装反应 将1 μL 2 μM S1加入到步骤(2)剪切反应的混合物中在37℃下孵育1h， 之后再加入1μL  2 μM S2在37℃下孵育2h， 然后在反应体系中加入5 μL  2mg/ml链霉亲和素磁球， 并在37℃振荡 孵育0.5h， 通过磁力架经磁场作用将反应产物从混合物中分离， 然后与SYB R Green I混合 孵育0.5h， 使用荧 光分光光度计测定其 荧光强度。 4.于信号扩增的自组装免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒， 其 特征在于， 该 试剂盒包括以下组成部分： (1)RCA扩增试剂： P ‑DNA、 T4 DNA连接酶、 T4  DNA连接酶缓冲溶液、 phi29  DNA聚合酶、 dNTP、 phi2 9 DNA聚合酶 缓冲溶液； (2)Cas12a检测试剂： Cas12a、 crRNA、 生物素 标记的ssDNA； (3)自组装报告试剂： S1、 S2、 链霉亲和素磁 球、 SYBR Green I； 所述ssDNA的核苷酸序列为如SEQ  ID No.1所示， S1的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示， S2的核苷酸序列如SEQ  ID No.3所示， P ‑DNA的核苷酸序列如SEQ  ID No.4所示， crRNA的核 苷酸序列如SEQ  ID No.5所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438262 A 2基于信号扩增的 自组装免标记检测HBV的方 法和试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于生物检测领域， 具体涉及一种基于信号扩增的自组装免标记C RISPR生 物传感器 检测乙型肝炎病毒DNA。 背景技术 [0002]肝细胞癌(HCC)是一种常见的高致死率恶性肿瘤， 乙型肝炎病毒(HBV)是其主要病 因之一， HBV可以通过多种机制促进HCC的发生。 乙肝病毒 可以通过肠外和性途径进行传播， 其潜伏期大约为1 ‑6个月。 到目前为止， 预防HBV感染的策略是接种疫苗。 然而， 疫苗接种可 能对部分人群无效。 当人感染HBV时， 血清中HBV  DNA浓度升高， 可以被检测到。 因此， DNA检 测可能成为HBV早期诊断的重要方法。 [0003]近年来， 出现了多种检测乙肝病毒感染的分析技术， 包括电化学， 电化学发光、 分 子印迹法、 表面增强拉曼散射(SERS)、 荧光、 比色等， 在这些方法中， 荧光方法具有简单、 无 放射性、 低成本和高灵敏度等突出优点， 凭借这些优点促进了荧光在生物传感方式的发展。 但仅通过目标与信号输出为1:1信号输出原位杂交模式， 灵敏度较低， 不能满足实际需求， 所以在信号输出之前结合信号放大策略实现高灵敏度检测。 随着， 核酸扩增策略， 特别是基 于等温扩增的方法， 它们可以提高在恒定温度下的检测灵敏度而被广泛应用。 例如： 聚合酶 链式反应(PCR)、 链置换扩增(SDA)、 滚环扩增(RCA)、 滚环转录(RCT)以及基于杂交链式反应 (HCR)等。 因此， 将信号 放大策略应用于传感策略中在临床诊断中是非常可 取的。 [0004]CRISPR‑Cas系统是由聚集的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和 CRISPR相关蛋 白(Cas)组成， 是生物学界一项很有前途的新技术。 随着CRISPR ‑Cas系统的不断发展， 不仅 应用在基因编辑方面， 同时在生物传感领域也开始了一场革命。 CRISPR ‑Cas系统能够实现 精确的基于序列的识别和高效的核酸催化裂解。 根据其信号输出方式已经存在有荧光、 电 化学、 电化学发光、 比色等， 上述输出方式中， 大多 数以标记探针为主， 而其中荧光标记探针 的合成步骤繁琐， 成本高， 并且容易造成信 号泄漏。 因此， 荧光染料SYB R Green I(SG I)对 双链DNA(dsDNA)的荧光特异性吸引了科学工作者的兴趣。 但荧光增强效率与dsDNA的数量 有关， 需要提供高含量的dsDNA来增 加来改善荧 光增强。 发明内容 [0005]本发明所要解决的技术问题为： 本发明的第一目的是提供一种非诊断目的的基于 信号扩增的自组装免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒DNA的方法， 本发明的另一 目的是提供一种基于信号扩增的自组装免标记CRISPR生物传感器检测乙型肝炎病毒DNA的 试剂盒。 [0006]本发明的技术方案为： 非诊断目的的基于信号扩增的自组装免标记C RISPR生物传 感器检测乙型肝炎病毒DNA的方法， 包括以下步骤： [0007](1)提取待检测的HBV核酸样本DNA， 与P ‑DNA环化后进行RCA扩增； [0008](2)将步骤(1)的扩增产物与Cas12a、 crRNA和生物素标记的ssDNA混合， 孵育反应说　明　书 1/8 页 3 CN 114438262 A 3