(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210156093.1 (22)申请日 2022.02.21 (30)优先权数据 2021106292 2021.08.21 AU (71)申请人 广东省农业科 学院农业 生物基因研 究中心 地址 510640 广东省广州市天河区金颖路 20号 申请人 广东新基鸸鹋实业有限公司 (72)发明人 张晓爱　于跃江　曹婉怡　陈庄　 张铁军　魏文康　彭长禄　王志林　 (74)专利代理 机构 北京众达德权知识产权代理 有限公司 1 1570 代理人 张晓冬(51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方 法 (57)摘要 本发明提供一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟 性别鉴定方法， 涉及雏鸟性别鉴定技术领域， 包 括鸸鹋羽毛采样、 DNA提取、 引物设计、 PCR反应、 琼脂糖电泳进行鸸鹋性别鉴定步骤。 本发明， 通 过分析最新公布的鸸鹋基因组中Z与W染色体序 列差异， 设计了一组性别鉴定引物， 通过PCR和电 泳来鉴定鸸鹋的性别， 用于鉴定的样本是少量的 羽毛、 而非血液和肉， 所以对鸸鹋没有伤害， 同时 也减少了在抓捕取样过程鸸鹋对 人的攻击， 是一 种无创鉴定技， 通过优化基因组DNA提取方法和 PCR退火温度， 实现了羽毛中微量DNA的提取和 PCR扩增， 性别鉴定引物的特异性好， 用于性别鉴 定的电泳 条带清晰明亮， 是一种准确可靠的鉴定 技术。 权利要求书2页 说明书6页 附图2页 CN 114292926 A 2022.04.08 CN 114292926 A 1.一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟性别鉴定方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： S1： 在鸸鹋养殖场对鸸鹋雏鸟佩戴好标有编号的脚环标记， 然后对进行采样， 采取幼鸟 背部和尾部羽毛5根， 放入低温冷藏盒送往检测的实验室； S2： 将2根羽毛的根部0.5cm处剪下， 然后剪碎放入装有180μl组织裂解液TL 的1.5ml离 心管中， 加入20 μl的蛋白酶K(20mg/ml)， 立刻涡旋振荡充分 混匀， 从而得到裂解物； S3： 将裂解物放置在55℃水浴过夜直到组织消化完全， 然后加入200μl结合液CB， 立刻 涡旋振荡充分混匀， 70℃放置10分钟， 待其自然冷却后加入100 μl异丙醇， 立刻涡旋振荡充 分混匀， 得到混合物； S4： 用1ml的枪头吸取混合物， 将混合物加入一个吸附柱AC中， 将吸附柱放入收集管中 以13000rpm离心60秒， 倒掉收集管中的废液， 加入200 μl抑制物去除液IR， 以12000rpm离心 30秒， 倒掉废液， 加入700μl漂洗液WB， 以12000rpm离心30秒， 倒掉废液， 加入500μl漂洗液 WB， 以120 00rpm离心3 0秒， 倒掉废液； S5： 将吸附柱AC放回空收集管中， 以13000rpm离心2分钟， 去除漂洗液， 然后取出吸附柱 AC， 放入一个干净的离心管中， 在吸附膜的中间部位加50 μl洗脱缓冲液EB， 室温放置3 ‑5分 钟； S6： 然后以12,000rpm离心1分钟， 然后丢弃吸附柱AC， 保留含DNA溶液的收集管， 用核酸 蛋白测定仪对DNA进 行浓度测定， 从而 得到提取的基因组DNA， 对提取的基因组DNA进 行包保 存； S7： 根据鸸鹋Z和W染色体的差异短序设计3条引物Emu ‑SD1、 Emu‑SD2和Emu ‑SD3来区分 雌雄， 引物Emu ‑SD2对应的区域仅存在于W染色体上， 为雌性鸸鹋所特有， 然后在引物Emu ‑ SD2区域的上游和下游各选取了一个Z、 W序列相同区作为引物Emu ‑SD1和引物Emu ‑SD2的设 计区， 所设计的引物 Emu‑SD1的序列为AGCTGCTTTGCTACTGCTTTATCCT， 引物Emu ‑SD2的序列为 AATGAGTGTCTCAGTACTC CTTTG， 引物Emu ‑SD3的序列为TAG GAATTAATTACTCAGGTAAAAC； S8： 然后进行PCR分反应， PCR反应 体系(50 μl)如下： PCR反应条件如下：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114292926 A 2且②‑④循环35次； S9： 将PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳分离， 0.5XTBE电泳缓冲液， 150V， 电泳40min， DNA染料为NA ‑Red， 紫外下拍照后将电泳 条带与DL2000 DNA ladder对比， 出现166bp雌性特 异性条带的为雌性鸸鹋， 缺少166bp雌性特异性条带， 包含1条409bp左右的扩增条带， 为雄 性鸸鹋。 2.根据权利要求1所述的一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟 性别鉴定方法， 其特征在于： 所 述步骤S1中采样时， 采样者需要穿戴一次性手套拔取每只鸸鹋幼鸟背部和尾部羽毛5根， 每 次拔羽后， 需要使用手套翻转包裹羽毛， 用夹子夹紧手套， 然后将羽毛 连同手套放入低温冷 藏盒内进行存放。 3.根据权利要求1所述的一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟 性别鉴定方法， 其特征在于： 所 述步骤S5中洗脱缓冲液在使用前， 可以放入6 5‑70℃的水中进行 预热。 4.根据权利要求1所述的一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟 性别鉴定方法， 其特征在于： 所 述步骤S6中使用到的核酸蛋白测定 仪为美国Nan odrop ND‑2000超微量核酸蛋白测定 仪。 5.根据权利要求1所述的一种快速准确无创的鸸鹋雏鸟 性别鉴定方法， 其特征在于： 所 述步骤S6中提取到的基因 组DNA需要在 ‑20℃下进行保存。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114292926 A 3