(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210157840.3 (22)申请日 2022.02.21 (71)申请人 自然资源部第三海 洋研究所 地址 361005 福建省厦门市思明区大 学路 178号 申请人 福建海洋研究所 (72)发明人 李渊　张丽艳　刘世刚　王芮　 宋普庆　林龙山　 (74)专利代理 机构 江苏德善律师事务所 3248 8 专利代理师 赵鹏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种鉴别澳大利亚小裸胸鳝隐存种与小裸 胸鳝的分子 遗传学方法 (57)摘要 本发明提供一种鉴别澳大利亚小裸胸鳝隐 存种与小裸胸鳝的分子遗传学方法， 采用线粒体 COI基因片段作为分子标记对小裸胸鳝隐存种与 小裸胸鳝进行鉴别， PCR扩增程序使用的引物序 列 如 下 ：S E Q  I D N O .3 ：G M ‑F : 5’‑ ACAATGTCATCGTAACAGC ‑3’； SEQ ID NO.4： GM‑R: 5’ ‑GTAATGCCAGCTGCTAGTAC ‑3’。 本发明通过由小 裸胸鳝隐存种和小裸胸鳝 mtDNA COI基因421  bp 序列排序结果可以看出小裸胸鳝隐存种与小裸 胸鳝存在22个碱基的差异， 表现为20个转换， 2 个 颠换。 其结果稳定， 可重复性强， 因此基于COI基 因的碱基差异可以作为小裸胸鳝隐存种和小裸 胸鳝的种质区分的分子标记， 鉴别方法简单， 易 推广。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 115261483 A 2022.11.01 CN 115261483 A 1.一种鉴别澳大利亚小裸胸鳝隐存种与小裸胸鳝的分子遗传学方法， 其特征在于： 采 用线粒体COI基因片段作为分子标记， 对小裸胸鳝隐存种与小裸胸鳝进行鉴别， PCR扩增程 序使用的引物序列如下： SEQ ID NO.3： GM‑F: 5’ ‑ACAATGTCATCGTA ACAGC‑3’； SEQ ID NO.4： GM‑R: 5’ ‑GTAATGCCAGCTGCTAGTAC ‑3’。 2.如权利要求1所述的鉴别澳大利亚小裸胸鳝隐存种与小裸胸鳝的分子遗传学方法， 其特征在于： 所述PCR扩增的反应 体系组成为： 10×buffer缓冲液           2.5 μL； dNTPs                     2 μL； rTaq酶                    0.15 μL； DNA模板                   1 μL； GMF引物                   1 μL； GMR引物                   1 μL； ddH2O补增至25  μL。 3.如权利要求1所述的鉴别澳大利亚小裸胸鳝隐存种与小裸胸鳝的分子遗传学方法， 其特征在于： 所述PCR扩增程序为： 95℃预变性5  min； 95℃变性3 0 S， 50℃退火3 0 S， 72℃延伸3 0 S， 28个循环； 72℃延伸10  min， 4℃保存。 4.用于鉴别澳大利亚小裸胸鳝隐存种与小裸胸鳝的引物和试剂盒， 其特征在于： 包括 以下引物序列： SEQ ID NO.3： GM‑F: 5’ ‑ACAATGTCATCGTA ACAGC‑3’； SEQ ID NO.4： GM‑R: 5’ ‑GTAATGCCAGCTGCTAGTAC ‑3’。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261483 A 2一种鉴别澳大利亚小裸胸鳝隐存种与小裸胸鳝的分子遗传学 方法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物技术领域， 具体涉及 一种鉴别小裸胸鳝隐存种与小裸胸鳝的 分子标记、 引物及方法。 背景技术 [0002]小裸胸鳝 （ Gymnothorax  minor (Temminck  & Schlegel,  1846)） ， 隶属鳗鲡目、 海 鳝科、 裸胸鳝属， 属于反赤道分布种。 [0003]小裸胸鳝隐存种采集于澳大利亚西北部沿海， 其外部形态与小裸胸鳝极其相似， 均具有如下特征： 体中长， 较侧扁， 尾部长略大于头与躯干部长。 头中大， 锥形。 吻短， 眼小而 圆， 眼间隔宽， 隆起。 鼻孔每侧2个， 分离； 前鼻孔短管状， 近吻端； 后鼻孔较大， 无皮瓣或短 管， 位于眼前缘上方。 口大， 前位， 口裂伸达眼后方， 口裂长几为头长1/3。 上下颌约等长， 或 上颌稍突出。 牙尖锐， 侧扁； 上下颌牙一行， 前方牙的前后缘具锯齿， 后方牙锯齿不明显； 前 颌骨齿一行， 与上颌牙同形， 中间具1~3个大犬牙， 可以倒伏； 犁骨齿一行， 较小。 鳃孔窄小， 裂缝状。 肛门位于体中部稍前方。 脊椎骨数129~135。 体无鳞， 皮肤光滑， 侧线孔不明显。 背鳍 起点在鳃孔的前上方。 臀鳍起点在肛门后方。 背鳍、 臀鳍和 尾鳍较发达， 相连续。 无胸鳍。 体 淡褐色， 由头部至尾端 具18~23条褐色横带。 体背侧方横带之间和头部均散布 不规则褐色斑 点， 腹面无斑点。 [0004]由于该隐存种与小裸胸鳝的外部形态非常相似， 仅凭借外部形态特征很难将两者 区分。 因此寻找区分小裸胸鳝隐存种和小裸胸鳝的可靠标准， 从混杂的种质中鉴别、 分离成 为一个亟待解决 的问题。 这将有助于解决种质混杂等问题， 为种质保护、 合理利用以及种质 的生物多样性研究提供技 术支撑。 发明内容 [0005]为了克服现有技术中缺陷， 从而提供一种鉴别澳大利亚小裸胸鳝隐存种与小裸胸 鳝的分子遗传学方法。 本发明要解决的技术问题在于提供一种鉴别小裸胸鳝隐存种与小裸 胸鳝的分子标记、 引物及方法， 有助于解决裸胸鳝属鱼类种质混杂问题， 本发明方法操作简 单， 易于掌握， 准确性高。 [0006]为解决上述技术问题， 本发明提供如下技术方案一种鉴别澳大利亚小裸胸鳝隐存 种与小裸胸鳝的分子遗传学方法， 其中： 采用线 粒体COI基因片段作为分子标记对小裸胸鳝 隐存种与小裸胸鳝进行鉴别， PCR扩增程序使用的引物序列如下： SEQ ID NO.3： GM‑F: 5’ ‑ACAATGTCATCGTA ACAGC‑3’； SEQ ID NO.4： GM‑R: 5’ ‑GTAATGCCAGCTGCTAGTAC ‑3’。 [0007]优选的， 所述PCR扩增的反应 体系组成为： 10×buffer缓冲液          2.5 μL； dNTPs                    2 μL；说　明　书 1/5 页 3 CN 115261483 A 3