(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210159959.4 (22)申请日 2022.02.22 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114214434 A (43)申请公布日 2022.03.22 (73)专利权人 中国肉类食品综合研究中心 地址 100068 北京市丰台区洋桥70号 (72)发明人 王守伟　韦忆萱　李家鹏　李金春　 赵燕　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 孙怡 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 WO 2006090987 A1,20 06.08.31 CN 108330168 A,2018.07.27 CN 112941157 A,2021.0 6.11 审查员 田原 (54)发明名称 同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重 RT-PCR预混试剂冻干 球及其制备方法与应用 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 具体公开了同步 鉴别食品中多种动物源性成分的多重RT ‑PCR预 混试剂冻干球及其制备方法与应用。 本发明的制 备多重RT ‑PCR预混试剂冻干球的方法， 其中， 所 述冻干球包括多重荧光PCR反应体系和保护剂， 所述多重荧光PCR反应体系包含5对特异性引物 组合， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑10所示， 所 述保护剂包括聚乙二醇8000、 Triton  X‑100、 甘 露醇和海藻糖。 本发明方法制备的多重RT ‑PCR冻 干球， 可常温运输和储存， 能用于鉴别肉或肉制 品中是否含有猪、 牛、 绵羊、 山羊、 鸡、 鸭、 狗、 狐、 貉9种动物源性成分。 具有检测准确， 操作简便快 速高效的优点。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图12页 CN 114214434 B 2022.07.01 CN 114214434 B 1.一种制备多重RT ‑PCR预混试剂冻干球的方法， 其特征在于， 所述冻干球包括多重荧 光PCR反应体系和保护剂， 所述多重荧光P CR反应体系包含5对特异 性引物组合， 其核苷酸序 列如SEQ ID NO.1‑10所示； 所述保护剂由如下组分组成： 20.1wt%聚乙二醇8000、 1.8wt%  Triton X‑100、 6.15wt% 甘露醇、 6.15wt %海藻糖， 余 量为水； 每20μL所述多重荧光PCR反应体系包含： SYBR  Green Ⅰ  Master预混液10μL， SEQ  ID  NO.1‑2所示的引物各2.9pmol、 SEQ  ID NO.3‑4所示的引物各4.35pmol、 SEQ  ID NO.5‑6所示 的引物各6.35pmol、 SEQ  ID NO.7‑8所示的引物各2.4pmol、 SEQ  ID NO.9‑10所示的引物各 3.4pmol， 其余体积用d dH2O补足； 所述方法包括将所述多重荧光PCR反应体系与所述保护剂混合后， 先滴入液氮再进行 冷冻干燥的步骤； 所述冷冻干燥的工艺顺序依次为： 预冻 ‑40℃， 0.5h； 主干燥 ‑40℃， 0.1mbar， 0.5h； ‑35℃， 0.1mbar， 2 h；‑30℃， 0.1mbar， 10h； 0℃， 0.1mbar， 2h； 20℃， 0.05mbar， 2h； 终末干燥3 0℃， 0.01mbar， 3 h； 所述多重荧 光PCR反应 体系与所述保护剂的体积比为1： 0.2。 2.一种多重RT ‑PCR预混试剂冻干球， 其特征在于， 通过权利要求1所述的方法制备得 到。 3.权利要求2所述的冻干球在同步鉴别肉或肉制品中多种动物源性成分中的应用， 所 述动物源性成分为猪、 牛、 绵羊、 山羊、 鸡、 鸭、 狗、 狐和貉。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 应用时， 以待测肉或肉制品的DNA和复溶后 的所述冻干球的混合物为待测物， 使用RT ‑PCR方法进行检测， 以荧光信号对温度的一阶负 导数为纵坐标， 温度为横坐标， 得到熔解曲线峰值图， 根据熔解曲线峰值图中峰的个数和位 置判定结果； 每一种特异性扩增产物峰代表一种特定 的动物源性成分， 其中， Tm值在71.1~73.7 ℃ 范围内出现的熔解曲线峰为绵羊或山 羊源性成分检出； Tm值在74.0~75.4 ℃范围内出现的 熔解曲线峰为牛源性 成分检出； Tm值在76.2~78.1 ℃范围内出现的熔解曲线峰为狗或狐狸 或貉源性成分检出； Tm值在80.3~81.2 ℃范围内出现的熔解曲线峰为猪源性成分检出； Tm 值在84.7~87.5 ℃范围内出现的熔解曲线峰为鸡或鸭源性成分检出。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， RT ‑PCR反应条件为： （1） 预变性： 95℃， 5min； （2） 变性： 9 5℃， 15 s； 退火+延伸： 5 7℃， 45 s， 30个循环； （3） 熔解曲线： 9 5℃， 1min； 70 ℃， 1min； 以0.02℃/s速率升温至95℃， 同时连续检测荧 光强度； 降温至40℃， 1mi n。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114214434 B 2同步鉴别食品中多种动物源性成分的多重RT ‑PCR预混试剂冻 干球及其制备方 法与应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体地说， 涉及同步鉴别食品中多种动物源性成分的 多重RT‑PCR预混试剂冻干球及其制备 方法与应用。 背景技术 [0002]由于肉类掺假的情况屡见不鲜， 不仅侵害了消费者利益， 也会对整个肉类产业造 成巨大影响， 因此需要可靠的肉类快速真伪鉴别技术， 作为相关部门对肉类食品安全进行 监管的重要检测手段。 [0003]多重实时荧光PCR技术应用在物种鉴别领域， 具有特异性强、 灵敏准确、 高通量和 低成本的优点。 但由于实时荧光PCR反应体系中的核心组分Taq酶的活性对温度较为敏感， 且荧光染料需要避光等诸多因素， 因此这一类试剂在保存和运输条件上 的要求十分苛刻。 液体状态的试剂只能低 温避光保存以避免其性状发生变化从而影响使用效果。 其次， 目前 市面上应用于物种检测的荧光PCR产品多为各个组分独立封装的液体试剂盒形式， 除了运 输和保存的弊端外， 在使用时需要人工配制反应液， 操作繁琐且增 加了误差和错 误率。 [0004]液体试剂经过冷冻干燥排除95%~99%的水分后， 能够有效延长保存期。 但由于多重 PCR反应体系对酶稳定性要求极其苛刻， 使用常规的冻干保护剂和通用的冷冻干燥流程对 多重PCR反应体系进行冻干后依旧会导致多个扩增产物间比例发生巨大变化， 致使检测方 法失去原有效果。 因此， 为将P CR反应试剂在冻干过程中热敏性酶发生变性或失活的幅度降 到最低， 且保证其他组分如引物、 dNTP、 荧光染料在冻干前后具有相同的效力， 仍需要进行 进一步研究。 发明内容 [0005]本发明的目的是为了弥补现有 肉类鉴别技术的不足， 提供一种可同步、 快速鉴别 肉或肉制品中猪、 牛、 绵羊、 山羊、 鸡、 鸭、 狗、 狐、 貉9种源性成分 的多重荧光PCR预混试剂冻 干球及其制备 方法与应用。 [0006]为了实现该目的， 本发明的技 术方案如下： [0007]一种制备多重RT ‑PCR预混试剂冻干球的方法， 所述冻干球包括多重荧光PCR反应 体系和保护剂， 所述多重荧光PCR反应体系包含5对特异性引物组合， 其核苷酸序列如SEQ   ID NO.1‑10所示， 所述保护剂包括聚乙二醇80 00、 Triton X‑100、 甘露醇和海藻糖。 [0008]本发明的冻干球含有以猪、 牛、 绵羊、 山羊、 鸡、 鸭、 狗、 狐、 貉的线粒体D NA为靶序列 分别设计的5对特异性引物： 羊F/羊R、 牛F/牛R、 狗 狐貉F/狗 狐貉R、 猪F/猪R、 鸡鸭F/鸡鸭R， 其中， 羊F/羊R可同时扩增绵羊和山 羊源性成分； 狗狐貉F/狗狐貉R可同时扩增狗源性、 狐源 性和貉源性成分； 鸡鸭F/鸡鸭R可同时扩增鸡源性和鸭源性 成分。 应用本发 明提供的上述引 物组合， 以待测肉或肉制品的DNA 为模板， 使用多重荧光P CR方法进行检测时， 各特异 性引物 扩增产物的Tm值具有显著差异， 可通过熔解曲线峰图谱 （峰的个数和Tm值） 分析进行鉴别。说　明　书 1/8 页 3 CN 114214434 B 3