(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210163663.X (22)申请日 2022.02.22 (71)申请人 南方医科 大学 地址 510515 广东省广州市白云区沙 太南 路1023号 (72)发明人 唐时幸　林洪青　梁源浩　王海鹰　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 齐键 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种检测新型冠状病毒不同变异株的检测 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种检测新型冠状病毒不同 变异株的检测试剂盒及其应用。 该检测试剂盒包 括RAA引物组和crRNA。 该检测试剂盒能够能对目 前SARS‑CoV‑2主要变异株(包括Alpha、 Beta、 Delta、 Omicron)进行快速鉴别， 且反应 条件要求 低， 适用于基层实验室用相对廉价的即时检测 (POCT)设备进行检测； 检测结果 分析方法可以实 现多样化， 在蓝光下肉眼直接 可视识别； 耗时短， 与PCR技术相比速度快， 可在1 ‑1.5h内有明显检 测信号， 检测灵敏度可达1.0 ×104拷贝/μL， 具 有极高的应用前 景。 权利要求书1页 说明书16页 序列表9页 附图8页 CN 115125330 A 2022.09.30 CN 115125330 A 1.一组RAA引物组， 其特征在于， 所述RAA引 物组靶向新型冠状病毒变异株中的K417N、 T478K、 E484K、 N5 01Y、 D614G中的至少一个突变位 点。 2.根据权利要求1所述的RAA引物组， 其特征在于， 所述突变位点的5 ’端还含有PAM序 列。 3.根据权利要求1所述的RAA引物组， 其特征在于， 所述RAA引物组的核苷酸序列如SEQ   ID NO:1～11所示。 4.根据权利要求3所述的RAA引物组， 其特征在于， 所述RAA引物组中的上游引物为SEQ   ID NO:1～2、 4～8和10中的任意一个， 所述RAA引物组中的下游引物为SEQ  ID NO:3、 9和11 中的任意 一个。 5.一组crRNA， 其特征在于， 所述crRNA包括5 ’端的茎环结构序列和以及3 ’端的靶基因 互补序列， 其中， 所述靶基因为含有K417N、 T478K、 E484K、 N501Y和D614G中任一个位点的新 型冠状病毒S蛋白编码基因。 6.根据权利要求5所述的crRNA， 其特征在于， 所述crRNA的核苷酸序列如SEQ  ID NO:12 ～30所示。 7.一种新型冠状病毒检测试剂， 其特征在于， 所述检测试剂中含有权利要求1～4任一 项所述的RA A引物组和权利要求5～6任一项所述的crRNA。 8.根据权利要求7所述的检测试剂， 其特征在于， 所述检测试剂还含有单链DNA探针和 Cas12a蛋白。 9.根据权利要求8所述的检测试剂， 其特征在于， 所述单链DNA探针的核苷酸序列为： 5’ ‑TTATT‑3’。 10.权利要求1～4任一项所述的RAA引物组和/或权利要求5～6任一项所述的crRNA在 制备新型 冠状病毒检测试剂盒中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115125330 A 2一种检测新型冠状病毒不同变异株的检测试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及病毒检测领域， 具体涉及一种检测新型冠状病毒不同变异株的检测试 剂盒及其应用。 背景技术 [0002]新型冠状病毒(SARS ‑CoV‑2)已经演 化出多种变异株和亚型， 其中受关注的变异株 包括Alpha、 Beta、 Delta和Omicron等。 目前存在的新型冠状病毒变异株主要以刺突蛋白关 键突变为特征， 导致病毒致病力、 传播效率改变， 从而影响疫苗的保护率， 成为病毒疫情防 控的重中之重 。 [0003]相关技术中， 虽然通过病毒基因组序列分析能够发现和诊断SARS ‑CoV‑2的变异株 和亚型， 但缺乏能够实现现场检测的有效手段， 也不能做到高通量检测大量样本， 为疫情防 控的高效性带来了一定的困难。 目前SARS ‑CoV‑2病毒变异株的鉴别主要依赖于基因测序， 但不论是一代测序技术， 还是基于二代基因测序的宏基因组测序和第三代纳米孔高通量测 序， 都需要利用PCR扩增技术构建cDNA文库， 这类方法检测成本高昂， 需要专业性仪器， 且对 于操作人员的技术水平有一定的要求。 而且在测序后还需要利用专业的生物信息学软件， 对测序数据进行清洗和分析， 以获得病毒基因序列和相关的变异情况。 其虽然能够通过对 病毒基因序列的分析找出不同毒株的同源性， 鉴别其来源， 分析其演化过程， 跟踪其突变情 况， 但病毒基因测序对实验室配置要求高， 耗时长， 成本高， 对操作人员技术和专业知识要 求极高， 使其在SARS ‑CoV‑2变异株的快速鉴别应用上受到限制。 [0004]因此， 开发一种 快速、 灵敏、 便捷、 低成本的SARS ‑CoV‑2变异株鉴别方法及检测试 剂盒对于防控疫情、 早期发现突变 株具有重要意 义。 发明内容 [0005]本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。 为此， 本发明提出一 种检测新型冠状病毒不同变异株的检测试剂盒及其应用， 该检测试剂盒能够能对目前 SARS‑CoV‑2主要变异 株(包括Alpha、 Beta、 Delta、 Omicron)进行快速鉴别， 且反应条件要 求 低， 适用于基层实验室用相 对廉价的即时检测(POCT)设备进行检测； 检测结果分析方法可 以实现多样化， 在蓝光下肉眼直接可视识别； 耗时短， 与PCR技术相比速度快， 可在1 ‑1.5h内 有明显检测信号， 具有极高的应用前 景。 [0006]本发明的第一个方面， 提供一组RAA引物组， 所述RAA引物组靶向新型冠状病毒变 异株中的K417N、 T478K、 E484K、 N5 01Y和D614G中的至少一个突变位 点。 [0007]根据本发明的第一个方面， 在本发明的一些实施方式中， 所述新型冠状病毒包括 野生型和突变型新型 冠状病毒， 其中， 所述 突变型包括Alpha、 Beta、 Delta、 O micron。 [0008]在本发明的一些实施方式中， 所述K417N、 T478K、 E484K、 N501Y、 D614G突变位点来 自SARS‑CoV‑2‑S蛋白片段， 具体为GenBan k编号MN908947毒株序列的第215 63‑25384bp。 [0009]根据本发明的第一个方面， 在本发明的一些实施方式中， 所述突变位点的5 ’端还说　明　书 1/16 页 3 CN 115125330 A 3