(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210163391.3 (22)申请日 2022.02.22 (71)申请人 复旦大学 地址 200433 上海市杨 浦区邯郸路2 20号 (72)发明人 黄强　朱海霞　杜文豪　姜欣怡　 秦琴　 (74)专利代理 机构 上海正旦专利代理有限公司 31200 专利代理师 陆飞　陆尤 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) (54)发明名称 高精度腺嘌呤碱 基编辑器及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种高精度腺嘌呤碱基编辑 器及其应用。 本发明的腺嘌 呤碱基编辑器是将野 生型腺嘌呤碱基编辑器ABE8e的SpCas9(D10A)和 脱氨酶Ta dA*之间的linker从头设计并替换后所 得。 这些高精度腺嘌 呤碱基编辑器不仅大大缩短 了linker的长度， 而且在靶位点具有与野生型 ABE8e相当甚至更高的基因编辑活性。 并且这些 腺嘌呤碱基编辑器大大缩小了野生型ABE8e的编 辑窗口， 有效提高了ABE8e的编辑精度， 使之编辑 更加准确。 因而这六个高精度腺嘌呤碱基编辑器 在生物医药的精准基因编辑方面具有更大的应 用潜力。 权利要求书1页 说明书8页 序列表58页 附图3页 CN 114606227 A 2022.06.10 CN 114606227 A 1.一种高精度腺嘌呤碱基编辑器， 其特征在于， 是将野生型ABE8e的32个氨基酸的 linker即177位至208位氨基酸分别替换成ETRS、 NKTYPP、 TTEPPDN、 PAPA、 PAPAPAP、 A (EAAAK)2A后重组所得， 依次记为4L ‑ABE8e、 4P ‑ABE8e、 6L ‑ABE8e、 7L ‑ABE8e、 7P ‑ABE8e和 12EK‑ABE8e； 其核苷酸序列分别为SEQ  ID NO.3、 SEQ ID NO.5、 SEQ  ID NO.7、 SEQ  ID NO.9、 SEQ ID NO.11、 SEQ  ID NO.13所示， 氨基酸序列分别为SEQ  ID NO.4、 SEQ  ID NO.6、 SEQ  ID  NO.8、 SEQ ID NO.10、 SEQ  ID NO.12、 SEQ  ID NO.14所示。 2.一种表达载体， 其含有如权利要求1所述的多 核苷酸序列。 3.一种宿主细胞， 用于转 化如权利要求2所述的表达载体。 4.如权利要求1所述的六个高精度腺嘌呤碱基编 辑器的制备方法， 其特征在于， 具体步 骤包括： 首先， 构建如权利要求2所述的多核苷酸序列 表达载体； 然后， 将所述表达载体转化 至如权利要求3所述的宿 主细胞， 筛选并挑出单克隆； 最后， 将所述单克隆诱导表达， 并通过 亲和层析、 分子 筛方法从表达产物中分离出 所述的六个高精度腺嘌呤碱基编辑器。 5.一种如权利要求1所述的高精度腺嘌呤碱基编辑器或者如权利要求2所述的表达载 体作为编辑基因 组DNA的编辑工具在基因 组DNA片段的相关编辑中的应用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述基因编辑是编辑位点大于两个的多位 点编辑； 所述编辑的手段 是腺嘌呤(A)到鸟嘌呤(G)的碱基转换。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特性在于， 所述的六个高精度腺嘌呤碱基编辑器即 4L‑ABE8e、 4P ‑ABE8e、 6L ‑ABE8e、 7L ‑ABE8e、 7P ‑ABE8e和12 EK‑ABE8e作为编辑工 具， 包括与靶 标DNA片段匹配的引导sgRNA； 所述的六个高精度腺嘌呤碱基编辑器能够与介导它的sgRNA 组合， 对目的基因进行编辑。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特性在于， 所述的表达载体和与之匹配的引导sgRNA 一同转入宿主细胞， 对基因进行编辑。 9.根据权利 要求7所述的应用， 其特性在于， 所述多位点的腺 嘌呤(A)到鸟嘌呤(G)的碱 基转换， 是利用腺嘌 呤碱基编辑器对腺嘌 呤(A)的脱氨作用， 并通过宿 主细胞的修复系统对 双链之间的错配进行修复， 从而将碱基从腺嘌呤(A)转换成鸟嘌呤(G)。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114606227 A 2高精度腺嘌呤碱基编辑器及其应用 技术领域 [0001]本发明属于蛋白质工程 技术领域， 具体涉及腺嘌呤碱基编辑器及其应用。 背景技术 [0002]如何精确有效地进行基因编辑一直是生命科学领域的重要 目标。 近年来， 人们 发 现CRISPR核酸酶可通过诱导靶双链DNA断裂(double ‑stranded DNA breaks,DSBs)刺激细 胞修复来实现基因组修饰的目的(1)。 但DSB引发的非同源末端连接(non ‑homologous  end  joining， NHEJ)修复通常无法人为控制， 可通过删除、 复制或其他DNA重排导致基因插入缺 失(Indel s)(2)。 加入供体DNA模板虽可以刺激同源定向修复(ho mology‑directed  repair， HDR)精确替换DNA等位基因， 但 这一过程主要限于分裂细胞(3)。 因此， 急 需开发一种在不诱 导DSB的情况 下精确修饰DNA的编辑 技术(4)。 [0003]为解决这一需求， David  R.Liu等开发了碱基编辑， 这是一种全新的基因组编辑技 术， 可直接转换目标碱基对， 无需DSB、 HDR或供体DNA模板， 有效减少了非必要的Indels产物 (5)。 一般来说， 碱基编辑器由保留单链切割活性的Cas蛋白(nickaseCas,nCas)和脱氨酶组 成。 在与DNA的目标位点结合后， 引导RNA(single  guide RNA， sgRNA)和靶DNA链(target   DNA,TS)之间的碱基配对导致 “R环”中的一小段非靶DNA链(non ‑target DNA,NTS)被置换, 接着该ssDNA 内的碱基被脱氨酶修饰产生突变(6)。 为了提高在真核细胞中的编辑效率， 单 链切口酶还在未编辑的DNA链中产生切口， 诱导细胞使用编辑的链作为模板来修复未编辑 的链(7)。 [0004]目前， 已有两种类型的DNA碱基编辑器被表 征： 胞嘧啶碱基编辑器(CBE)， 将C ·G碱 基对转换为T ·A碱基对， 以及腺嘌呤碱基编辑器(ABE)， 将A ·T碱基对转换为G ·C碱基对 (8,9)。 然而， 当前的CBE编辑效率较弱并具有高度位点依赖性， 因此它们的应用受到了严重 限制(7)。 相比之下， ABE显得更为重要， 因为它可以纠正ClinVar数据库中47％的疾病相关 点突变(4)。 为获得ABE系统,David  R.Liu等通过定向进化将大肠杆菌tRNA腺苷脱氨酶 (wtTadA)与Cas9的融合体进化为可催化腺苷脱氨的ABE8e， 该系统编码TadA* ‑linker‑ SpCas9(D10A)复合物， 其中Ta dA*为进化所得的wtTadA变体， 负责对底物DNA编辑； linker为 (SGGS)2‑XTEN‑(SGGS)2的接头序列， 负责连接SpCas9(D10A)和TadA*两个结构域； SpCas9 (D10A)保留了单链切口酶的活性， 负责在sgRNA的引导下靶向目标序列(10)。 作为一种高兼 容性的碱基编辑工具， ABE8e 具有广泛的应用前 景。 [0005]虽然ABE8e是一个强大的基因编辑工具， 但仍存在着许多有待解决的问题， 其中限 制其进一步应用的最大问题是ABE8e可以编辑底物DNA 中四到五个核苷酸窗口中的任何A， 即PAM远端的第四位到第八位核苷酸， 然而编辑靶位点以外的A会引入非必要产物， 从而导 致有害突变(9)。 为解决以上问题， 我们 对SpCas9(D10A)和TadA*之间的linker进行了从头 设计， 获得了编辑窗口明显缩小的六个ABE8e高精度突变体， 即分别是4L ‑ABE8e、 4P ‑ABE8e、 6L‑ABE8e、 7L ‑ABE8e、 7P ‑ABE8e和12 EK‑ABE8e， 从而 为基因编辑库提供了多个高精度基因编 辑工具。说　明　书 1/8 页 3 CN 114606227 A 3