(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210162190.1 (22)申请日 2022.02.22 (71)申请人 河北佑仁生物科技有限公司 地址 050000 河北省石家庄市高新区方亿 科技园A区3号楼1层01、 02、 04室 (72)发明人 李红臣　寇佳琳　 (74)专利代理 机构 河北冀华知识产权代理有限 公司 13151 代理人 李瑞妍 (51)Int.Cl. C07K 14/165(2006.01) C12N 15/50(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/70(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 一种新型 冠状病毒S蛋白的表达方法 (57)摘要 本发明涉及一种新型冠状病毒S蛋白的表达 方法， 包括以下步骤： A、 PCR扩增； B、 将步骤A得到 的扩增产物进行电泳纯化后与制粒连接； C、 将重 组质粒热激转化BL21(DE3)大肠杆菌； D、 配置培 养基； E、 将重组大肠杆菌的种子液按照3% 接种量 接种到培养基中培养； F、 诱导表达蛋白， 然后离 心收集菌体， 并使用超声波进行菌体破碎， 然后 使用洗脱纯化得到新型冠状病毒S蛋白。 本发明 提高了新型 冠状病毒S蛋白表达的效率。 权利要求书1页 说明书2页 序列表2页 附图1页 CN 114380896 A 2022.04.22 CN 114380896 A 1.一种新型 冠状病毒S蛋白， 其特 征在于由SEQ  ID NO.1的氨基酸序列表示。 2.一种SEQ  ID NO.1的氨基酸序列表示新型冠状病毒S蛋白的编码基因， 其特征在于由 SEQ ID NO.2的核苷酸序列表示。 3.一种SEQ  ID NO.2的核苷酸序列表示的编码基因的上游引 物， 其特征在于 由SEQ ID  NO.3的核苷酸序列表示。 4.一种SEQ  ID NO.2的核苷酸序列表示的编码基因的下游引 物， 其特征在于 由SEQ ID  NO.4的核苷酸序列表示。 5.一种重组质粒， 其特 征在于包括SEQ  ID NO.2的核苷酸序列所表示的编码基因。 6.一种重组大肠杆菌， 其特征在于包含有SEQ  ID NO.2的核苷酸序列所表示的编码基 因。 7.一种权利要求1所述 新型冠状病毒S蛋白的表达方法， 其特 征在于包括以下步骤： A、 PCR扩增； 50 μL反应体系中， 加入1.5 μL的由SEQ  ID NO.2的核苷酸序列表示的新型冠 状病毒S蛋白编码基因， 50  μmol/L的由SEQ  ID NO.3的核苷酸序列表示的上游引物1μL， 50   μmol/L的由SEQ  ID NO.4的核苷酸序列表示的下游引物1μL， 1μL的15mmol/L的dNTP， 5 ×缓 冲液 10 μL， pfu  DNA聚合酶  0.5 μL， 其余用双蒸水补齐， PCR反应条件为94℃预变性5分钟， 94℃变性 40s， 56℃退火45s， 72℃延伸6 5s， 共45个 循环； B、 将步骤A得到的扩增产物进行电泳纯化， 将纯化后的新型冠状病毒S蛋白编码基因和 pPIC9质粒分别进行E coRⅠ和XhoⅠ双酶切， 然后使用T4  DNA连接酶连接， 得到 重组质粒； C、 将重组质粒热激转化BL21(DE3)大肠 杆菌， 然后使用80 μg/mL卡那霉素LB培养板进行 筛选， 得到重组大肠杆菌； D、 配置培养基； 培养基的成分为， 葡萄糖 6.5 g/L、 甘油  12g/L、 D‑山梨醇 10 g/L、 蛋白胨  5 g/L、 磷酸二氢钾  2.5g/L、 氯化铵 5g/L、 硫酸镁  5 g/L、 硫酸亚铁1.5  g/L、 柠檬酸钠  2.0 g/L、 酵母粉  1g/L、 三甲基 甘氨酸 3.0 g/L； 培养基的pH值 为7.3； E、 将重组大肠杆菌 的种子液按照3%接种量接种到培养基中， 培养温度为35～36℃， pH 值维持在7.3～7.5， 培 养3小时； F、 加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5  mmol/L， 诱导表达蛋白， 然后离心收集菌体， 并使用 超声波进行菌体破碎， 然后使用洗脱纯化得到新型 冠状病毒S蛋白。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114380896 A 2一种新型冠状病毒S蛋白的表达方 法 技术领域 [0001]本发明涉及生物技 术领域， 特别是一种新型 冠状病毒S蛋白的表达方法。 背景技术 [0002]新型冠状病毒 （SARS ‑CoV‑2） 是引发新型冠状病毒肺炎的病原体。 其中， 新型冠状 病毒的S蛋白通过不同的受体结合结构域与宿主细胞结合， 是宿主中和 抗体重要作用位点 以及疫苗设计的关键靶点。 如何高效大规模生产新型冠状病毒S蛋白成为了本领域的研究 热点之一。 发明内容 [0003]本发明要解决的技术问题是提供一种新型冠状病毒S蛋白的表达方法， 提高了新 型冠状病毒S蛋白表达的效率， 本发明所采取的技 术方案如下。 [0004]一种新型 冠状病毒S蛋白， 其由SEQ  ID NO.1的氨基酸序列表示。 [0005]一种SEQ ID NO.1的氨基酸序列表示的新型冠状病毒S蛋白的编码基因， 其由SEQ   ID NO.2的核苷酸序列表示。 [0006]一种SEQ ID NO.2的核苷酸序列 表示的编 码基因的上游引物， 其由SEQ  ID NO.3的 核苷酸序列表示。 [0007]一种SEQ ID NO.2的核苷酸序列 表示的编 码基因的下游引物， 其由SEQ  ID NO.4的 核苷酸序列表示。 [0008]一种重组质粒， 其包括SEQ  ID NO.2的核苷酸序列所表示的编码基因。 [0009]一种重组大肠杆菌， 其包 含有SEQ ID NO.2的核苷酸序列所表示的编码基因。 [0010]一种上述 新型冠状病毒S蛋白的表达方法， 包括以下步骤： A、 PCR扩增； 50 μL反应体系中， 加入1.5 μL的由SEQ  ID NO.2的核苷酸序列 表示的新 型冠状病毒S蛋白编码基因， 50  μmol/L的由SEQ  ID NO.3的核苷酸序列表示的上游引物1μ L， 50 μmol/L的由SEQ  ID NO.4的核苷酸序列表示的下游引物1 μL， 1 μL的15mmol/L的dNTP， 5 ×缓冲液 10 μL， pfu  DNA聚合酶  0.5 μL， 其余用双蒸水补齐， PCR反应条件为94℃预变性5分 钟， 94℃变性 40s， 56℃退火45s， 72℃延伸6 5s， 共45个 循环； B、 将步骤A得到的扩增 产物进行电泳纯化， 将纯化后的新型冠状病毒S蛋白编码基 因和pPIC9质粒分别进行E coRⅠ和XhoⅠ双酶切， 然后使用T4  DNA连接酶连接， 得到 重组质粒； C、 将重组质粒热激转化BL21(DE3)大肠杆菌， 然后使用80 μg/mL卡那霉素LB培养板 进行筛选， 得到重组大肠杆菌； D、 配置培养基； 培养基的成分为， 葡萄糖 6.5 g/L、 甘油  12g/L、 D ‑山梨醇 10 g/L、 蛋白胨  5 g/L、 磷酸二氢钾   2.5g/L、 氯化铵  5g/L、 硫酸镁 5 g/L、 硫酸亚铁1.5  g/L、 柠檬酸钠  2.0 g/L、 酵母粉  1g/L、 三甲基甘 氨酸 3.0 g/L； 培养基的pH值 为7.3；说　明　书 1/2 页 3 CN 114380896 A 3