(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210163082.6 (22)申请日 2022.02.22 (71)申请人 江苏省疾病预防控制中心 （江苏省 公共卫生研究院） 地址 210009 江苏省南京市江苏路172号 (72)发明人 付建光　邓斐　艾静　王慎骄　 樊欢　余慧艳　鲍倡俊　 (74)专利代理 机构 南京正联知识产权代理有限 公司 32243 专利代理师 卢霞 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重 荧光检测引物探 针组及试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种针对新冠病毒奥密克戎 变异株的多重荧光检测引物探针组及试剂盒。 本 发明具有如下技术效果： 1.造价低廉， 单个标本 总体的试剂成本为12元。 2.检测时间短， 操作简 便， 本发明需要的实验操作更加简便， 通用试剂 加上本发明的引物探针工作液即可上机检测， 并 能同时判断SARS ‑CoV‑2感染及是否奥密克戎变 异株感染， 总体检测时间约为1.5小时。 简单的操 作流程， 常规的荧光检测仪器设备， 基层单位也 可开展。 3.灵敏度高， 能够应用于环境标本检测， 环境标本量大， 病毒载量低， 给检测工作造成了 很大困难。 环 境样本由于病毒载量低很难开展高 通量测序， 本发 明的方法在对环 境样本进行检测 时也可定性至奥密克戎变异株 。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图7页 CN 115449563 A 2022.12.09 CN 115449563 A 1.针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重荧光检测引物探针组， 其特征在于， 所述的引 物探针组的核苷酸序列如下表所示： 名称 序列 SEQ ID NO ORF1a/b‑F GGATCAAGAATCCTTTGGTGG 1 ORF1a/b‑R GTCACAAAATCCTTTAGGATTTGGA 2 ORF1a/b‑Probe CATCGTGT TGTCTGTACTGC CGTTGCC 3 N‑F GACCCCAAAATCAGCGA AAT 4 N‑R TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG 5 N‑Probe ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC 6 S‑F ACTGAAATCTATCAG GCCGGT 7 S‑R CAACACCATAAGTGGGTCGGA 8 S‑Probe ACAAACCTTGTAATGGTGTTGCAGGT 9 所述荧光探针是一种寡核苷酸探针， 探针的5 ’末端连接有荧光基团， 探针的3 ’末端连 接有淬灭基团。 2.根据权利要求1所述的引物探针组， 其特 征在于， 所述检测ORF1a/b基因的探针的5 ‘端连有荧 光基团FAM， 3 ‘端连有淬灭基团BHQ1； 所述检测N基因的探针的5 ‘端连有荧 光基团VIC， 3 ‘端连有淬灭基团BHQ1； 所述检测S基因的探针的5 ‘端连有荧 光基团CY5， 3‘端连有淬灭基团BHQ2。 3.针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重荧光检测试剂盒， 其特征在于， 包括如权利要 求1或2所述引物探针组。 4.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特 征在于， 还 包括多重荧 光检测试剂。 5.根据权利要求4所述的试剂 盒， 其特征在于， 所述的多重荧光检测试剂为南京诺唯赞 的HiScript  II U+One Step qRT‑PCR Probe Kit试剂。 6.包含如权利要求1或2所述的引物探针组的引物探针工作液的制备方法， 其特征在 于， 包括如下步骤： 1)将各个引物及探针的合成干粉加无RNA酶水配制成10微摩尔/ 升的工作浓度； 2)将三种用于检测ORF1a/b基因、 N基因和S基因的引 物探针组， 分别按照上游引 物： 下 游引物： 探针的体积比为2:2:1的比例分别配置成三种探针引物混合液； 3)最后将三种探针引物混合液等体积混合制备为引物探针工作液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115449563 A 2一种针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重荧光检测引物探针 组及试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及一种针对新冠病毒奥密克戎变异株的多重荧光检测引物探针组及试 剂盒， 属于生物技 术领域。 背景技术 [0002] [0003]目前研究发现， 相比野生株或其他VOC， 奥密克戎变异株有更多突变， 变异速度快 (目前已有BA.1、 B A.2、 BA.3及BA.1.1四种型别， 且国内均已检出)， 很可能产生了比Delta突 变株更强的传染性和免疫逃逸能力， 降低了疫苗和中和抗体的效力， 且再次感染的风险增 加， 这对全球疫情防控提出了新挑战。 因此快速检测奥密克戎变异株感染， 并及时防控成为 了亟待解决 的问题。 但目前主流的检测方法是高通量测序， 经济成本高耗时长。 同时个别的 荧光检测试剂盒通量低， 造价高， 且操作复杂， 需提前检测出新冠病毒阳性， 然后用该试剂 盒进行专门的奥密克戎变异株检测， 基于以上原因很多基层检测单位难以第一时间开展奥 密克戎的检测， 耽误了宝贵的防控时间及防控策略的制定 。 [0004]目前上市的奥密克戎荧光检测试剂盒针对特定的几个变异位点进行检测， 造价昂 贵， 50人份约10000元， 单个标本的试剂成本为200元。 此外高通量测序方法造价更高， 单个 标本的试剂成本为20 00元。 [0005]现有的奥密克戎荧光试剂盒操作复杂。 需要先开展SARS ‑CoV‑2的荧光检测， 当 SARS‑CoV‑2荧光阳性时， 再用该试剂盒检测奥密克戎变异位点， 当几个变异位点荧光阳性 时才可确定该标本为 奥密克戎感染， 总体检测时间约为4小时。 高通量测序时间则长达20小 时。 [0006]中国专利CN202111497771.2提供了基于多重荧光定量ARMS ‑PCR技术的新冠病毒 奥密克戎突变序列检测技术及其应用， 主要基于荧光定量ARMS ‑PCR 技术针对目前奥密克 戎变异株S基因特异性突变类型， 如序列位置23599， 序列变化T>G、 序列位置23048， 序列变 化G>A、 序列位置23202， 序列变化C>A、 序列位置22898， 序列变化G>A进行单管或多管多重检 测。 [0007]虽然中国专利CN202111497771.2提供了基于多重荧光定量ARMS ‑PCR技术检测奥 密克戎突变序列的技术方案， 但是其也存在如下技术问题： 1)其针对  S区的单独的突变位 点进行检测， 而S区是SARS ‑CoV‑2突变最活跃的基因 区域， 奥密克戎的突变速度更是远高于 其他变异株， 因此当目标位点的核苷酸发生变异 时， 仅针对单独位点进行检测有可能造成 假阴性； 2)该专利申请时间为2021  年12月， 此时奥密克戎变异 株较少， 仅有BA.1一个型别， 但是截止到2022年  2月10日全球已经出现了B A.1、 BA.2、 BA.3及BA.1.1四种型别， 各个型别 之间变异较大， 很难保证该技术的有效性； 3)需要先使用其他试剂盒检测出  SARS‑CoV‑2阳 性， 然后再利用该 试剂盒判断是否为奥密克戎感染， 操作繁琐， 造价高。说　明　书 1/7 页 3 CN 115449563 A 3