(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221016496 0.6 (22)申请日 2022.02.22 (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市海珠区新港西 路135号 申请人 湖南银鱼农业科技有限公司 (72)发明人 夏军红　李碧君　朱宗贤　林翊隆　 艾春晖　王振斌　刘小燕　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 段卉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一对用于罗非鱼耐低温性状相关的微卫星 标记的检测引物 (57)摘要 本发明属于鱼类养殖技术领域， 涉及一对用 于罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的检测 引物。 本发 明提供了一对与罗非鱼耐低温性状相 关的微卫星标记的检测引物， 所述检测引物核苷 酸序列如SEQ  ID NO 1和2所示。 利用分子标记 SSR613719设计的引物， 筛选微卫星标记 SSR613719基因型为lm的作为亲本 的基因型， 进 而选择耐寒性能更强的个体。 利用本发明的微卫 星标记可以快速鉴定并筛选耐寒性能好的罗非 鱼亲鱼， 从而有助于解决耐寒罗非鱼传统育种中 育种周期长、 成本高等问题， 进而促进耐寒罗非 鱼的发展。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图3页 CN 114410804 A 2022.04.29 CN 114410804 A 1.一对用于罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的检测引物， 其特征在于， 所述检测 引物的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1和2所示。 2.权利要求1所述检测引物在鉴定罗非鱼耐低温性状相关的微 卫星标记中的应用。 3.权利要求1所述检测引物在制备鉴定罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的试剂盒 中的应用。 4.根据权利要求2或3所述应用， 其特 征在于， 所述罗非鱼为吉富罗非鱼。 5.一种检测罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要 求1所述的检测引物。 6.根据权利 要求5所述试剂盒， 其特征在于， 还含有PCR试剂、 PAGE胶电泳试剂和银染显 色试剂。 7.根据权利要求6所述试剂盒， 其特征在于， 所述PCR试剂的反应体系为2 ×PCR DS Mix  9～11 μL， 权利要求1所述检测引物的引物对的上下游引物各0.8～1.0 μL， 模板DNA  3～5 μL， 补充水至总体积20 μL。 8.根据权利要求6所述试剂盒， 其特征在于， 所述PCR试剂的反应条件为94～95℃预变 性3min， 变性94～95℃30s， 退火58～61℃40s， 延伸71～72℃30s， 循环数为35， 71～72℃延 伸10min。 9.权利要求5～8任一所述试剂盒在鉴定罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记中的应 用。 10.权利要求1所述引物和/或权利要求5所述的试剂盒在耐寒罗非鱼分子辅助育种 中 的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410804 A 2一对用于罗非鱼耐低温性状相关的微卫星标记的检测引物 技术领域 [0001]本发明属于鱼类养殖技术领域， 具体地， 涉及一对用于罗非鱼耐低温性状相关的 微卫星标记的检测引物。 背景技术 [0002]罗非鱼(Oreochromisspp)是世界上最重要的经济鱼类之一， 预计2017年产量约为 640万吨。 中国的罗非鱼产量居世界首位。 中国常见养殖罗非鱼有尼罗罗非鱼 (Oreochro misniloticus)来源的不同品系、 蓝罗非鱼(Oreochro misaureus)、 莫桑比克罗非 鱼(Oreoc hromismossambicus)和红罗非鱼， 此外还有许多杂交品系。 [0003]罗非鱼原产于热带和亚热带地区， 不耐低温。 在中国， 低温对罗非鱼养殖的影响很 大； 不耐低温的特点限制 了罗非鱼的养殖面积。 冬季低温和寒潮常常导致罗非鱼大量死亡 造成显著的经济损失。 通过提高罗非鱼抗寒性能， 不仅可以延 长其生长周期、 降低越冬死亡 率， 而且可以减少养殖成本、 扩大养殖面积， 从而促进行业的可持续性发展(Li  SF,Li CH, Dey M,Gagalac  F,Dunham  R(2002)Cold  tolerance  of three strains of Nile  tilapia,Oreoc hromisniloticus,i n China.Aquaculture,213,123 ‑129)。 [0004]现有技术中， 针对罗非鱼耐寒性能的研究也有不少。 通过不同方法和对不同群体 的研究发现： 罗非鱼的致死温度是有差异的， 常见 的不同罗非鱼养殖品种存在耐寒性能的 差异。 对尼罗罗非鱼三个品系的研 究发现， 吉富罗非鱼死亡温度范围为11℃～8.4℃， “78” 品系为9.8℃～7.4℃， “88”品系为11℃～7.4℃； 通过五个品系罗非鱼耐寒能力的试验发 现： 美国奥利亚罗非鱼的耐寒能力最 强， 极显著高于埃及品系、 泰国品系和吉富品系， 其中， 吉富罗非鱼的耐寒性最低； 在尼罗罗非鱼5个品系的耐寒性能比较中发现， 耐寒能力高低 为： 埃及品系＞广东品系＞美国品系＞泰国品系＞吉富品系， 半致死温度分别为8.86、 9.30、 9.39、 9.5 7和10.13℃(林勇,卢其西,杨慧赞,陈忠,黄姻,甘西,曾兰,唐章生(2 011)八 种品系罗非鱼及其尼奥罗非鱼耐寒性能的比较试验.华北农学报,26,278 ‑282.)； 对吉富罗 非鱼采用不同速率降温处理， 发现半致死低 温随降温速率加快而降低(马旦梅,程光平,喻 海燕,邓荣志(2010)吉富罗非鱼对不同降温速率胁迫的死亡反应研究.广西畜牧兽医,26, 200‑203.)； 低温胁迫试验发现美国品系、 夏奥1号和广东品系的奥利亚罗非鱼耐寒性能有 显著差异， 半致死温度分别为7.82、 8.22、 8.44℃； 连续三年观测发现， “新吉富”罗非鱼开始 死亡和100％死亡的水温为11℃、 5.8℃， “吉丽”罗非鱼为12℃、 9.2℃， 萨罗罗非鱼为13.8 ℃、 12.4℃(王兵,李思发,蔡完其(2011) “新吉富”罗非鱼、“吉丽”罗非鱼及萨罗罗非鱼耐寒 力的测定.上海海洋大学学报,20,499 ‑503.)； 使用 尼罗罗非鱼三个品系为母本， 奥里亚罗 非鱼为父本， 杂交获得的子一代中， 埃奥鱼(奥利亚罗非鱼x埃尼尼罗罗非鱼)、 湘奥鱼(奥利 亚罗非鱼x湘湖尼罗罗非鱼)和吉奥鱼(奥利亚罗非鱼x吉富尼罗罗非鱼)半致死低温分别 为： 8.63℃、 8.23℃、 7.60℃(王茂元,钟全福,田田,吴妹英,胡振禧(2016)不同杂交罗非鱼 F_1代耐寒性能的研究.福建农业学报,31,849 ‑852.)； Harrison等人对尼罗罗非鱼研究发 现， 其在13.68℃时开始死亡， 而8.68℃时全部死亡。 鱼的体重和行为与耐寒性之间存在显说　明　书 1/8 页 3 CN 114410804 A 3