(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210160148.6 (22)申请日 2022.02.22 (71)申请人 广州双螺 旋基因技术有限公司 地址 510000 广东省广州市黄埔区国际生 物岛螺旋四路7号第三层3 02单元 申请人 福建省水产技 术推广总站 （福建省 水生动物疫病预防控制中心） 　 漳浦县水产技 术推广站 (72)发明人 张璜　林楠　许智海　高金艳　 林雪金　余嘉明　林梦蝶　 (74)专利代理 机构 广州凯东知识产权代理有限 公司 44259 专利代理师 曾志环 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01)C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称 一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定 量PCR引物组及试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测欧洲鳗鲡圆环 病毒的荧光定量PCR引物组及试剂盒， 试剂盒包 含所述引物组， 所述引物组由正向引物F、 反向引 物R和荧光探针Q组成， 试剂盒还包括DNA聚合酶， UDG酶， 2×反应缓冲液， 密封液， 阳性对照品、 阴 性对照品。 本发 明提供的试剂盒可直接从复杂样 品中检测欧洲鳗鲡圆环病毒， 具有特异性强、 灵 敏度高、 实验重复性好、 操作便捷快速的优点， 不 需要昂贵仪器 即可完成检测， 可用于欧洲鳗鲡圆 环病毒的现场快速、 准确检测。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图3页 CN 114438263 A 2022.05.06 CN 114438263 A 1.一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧 光定量PCR引物组， 其特 征在于： 所述引物组由正向引物F、 反向引物R和荧光探针Q组成， 所述正向引物F的核苷酸序列 如SEQ ID NO:1所示， 反向引物R的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示， 荧光探针Q的核苷酸序 列如SEQ ID NO:3所示。 2.根据权利要求1所述的一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病 毒的荧光定量PCR引物组， 其特 征在于： 所述荧光探针Q的5 ’端标记荧 光基团， 3 ’端标记淬灭基团。 3.一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧 光定量PCR试剂盒， 其特 征在于： 包含权利要求1所述的引物组。 4.根据权利要求3所述的一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病 毒的荧光定量PCR试剂 盒， 其特 征在于： 还包括DNA聚合酶， UDG酶， 2 ×反应缓冲液， 密封液， 阳性对照品， 阴性对照品。 5.根据权利要求3所述的一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病 毒的荧光定量PCR试剂 盒， 其特 征在于： 所述2×反应缓冲液 是含有dATP、 dCTP、 dGTP、 dU TP的反应液。 6.根据权利要求3所述的一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病 毒的荧光定量PCR试剂 盒， 其特 征在于： 所述DNA聚合酶为Taq酶， UDG酶为热 敏型尿嘧啶 ‑DNA糖基化酶， 密封液为矿物油。 7.根据权利要求3所述的一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病 毒的荧光定量PCR试剂 盒， 其特 征在于： 所述阳性对照品为含有欧洲鳗鲡圆环病毒检测靶标基因的质粒DNA， 质粒DNA浓度为 106copies/ μL， 所述阴性对照为灭菌超纯 水。 8.根据权利要求3所述的一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病 毒的荧光定量PCR试剂 盒， 其特 征在于： 其反应体系成分组成为： 终浓度为0.2～0.6 μM的正向引物F， 终浓度 为0.2～0.6 μM的反 向引物R， 终浓度为0.1～0.3 μM的荧光探针Q引物， 2 ×反应缓冲液12.5 μL， DNA聚合 酶2～5U， UDG酶0.3～0.7U， 待检样品5 μL， 加灭菌超纯 水至25 μL。 9.根据权利要求8所述一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病 毒的荧光定量PCR试剂盒， 其特征 在于： 其反应体系成分组成为： 终浓度 为0.4 μM的正向引物F， 终浓度 为0.4 μM的反向引物 R， 终 浓度为0.2 μM的荧光探针Q引物， 2 ×反应缓冲液12.5 μL， DNA聚合酶4U， UDG酶0.5U， 待检样品 5 μL， 加灭菌超纯 水至25 μL。 10.根据权利要求3 ‑9任一所述一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR试剂 盒， 其特征在于： 其反应体系的反应条件为5 0℃5min； 95℃5mi n； 95℃15s、 6 0℃30s 45个循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438263 A 2一种用于 检测欧洲鳗鲡圆环病毒 的荧光定量PCR引物组及 试 剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及一种 病毒检测技 术领域， 尤其涉及欧洲鳗鲡圆环病毒检测技 术。 背景技术 [0002]欧洲鳗鲡圆环病毒是圆环病毒科圆环病毒属成员， 是引起鳗鲡病毒性疾病的病原 之一。 目前国外已经在 海龟、 鳗鲡、 鲃 鱼、 鲶鱼等水生动物检测出圆环病毒的报道， 国内关于 鳗鲡病毒性疾病的研究较少， 有研究者从160份急性大量死亡的疑似鳗鲡病毒性疾病病料 检测出高达40.6％鳗鲡圆环病毒 阳性率， 这表明鳗鲡圆环病毒 可能会严重危害鳗鲡养殖产 业的发展。 [0003]目前对欧洲鳗鲡圆环病毒的生物学检测技术也仅基于传统PCR检测技术， 其检测 过程操作步骤多， 耗时长， 且过程易造成气溶胶污染。 实时荧光定量PCR(Quantitative   Real－time  PCR)是在常规PCR技术的基础上添加荧光染料或荧光探针， 利用荧光信号积累 实时监测整个PCR进程， 通过标准曲线对未知浓度模板进行定量分析的方法。 与普通PCR技 术相比， 实时荧光定量PCR技术的TaqMan探针特异性强， 可进行单个核苷酸的区分， 同时操 作更简便， 检测时间更短。 为欧洲鳗鲡圆环病毒的分子生物学诊断提供了一种快速、 准确的 检测手段。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引物组及 试剂盒， 以解决现有技 术中缺乏欧洲鳗鲡圆环病毒的分子生物学诊断的基础。 [0005]为了达到上述目的本发明采用如下技 术方案： [0006]一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引 物组， 所述引物组由正向引物 F、 反向引物R和荧光探针Q组成， 所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示， 反向引 物R的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示， 荧 光探针Q的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示。 [0007]进一步地， 所述荧光探针Q的5 ’端标记荧 光基团， 3 ’端标记淬灭基团。 [0008]本发明还提供一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒， 其包含权 利要求1所述的引物组。 [0009]更优地， 试剂盒还包括DNA聚合酶， UDG酶， 2 ×反应缓冲液， 密封液， 阳性对照品， 阴 性对照品。 [0010]更优地， 所述2 ×反应缓冲液 是含有dATP、 dCTP、 dGTP、 dU TP的反应液。 [0011]更优地， 所述DNA 聚合酶为Taq酶， UDG酶为热敏型尿嘧啶 ‑DNA糖基化酶， 密封液为 矿物油。 [0012]更优地， 所述阳性对照品为含有欧洲鳗鲡圆环病毒检测靶标基因的质粒D NA， 所述 阴性对照为灭菌超纯 水。 [0013]更优地， 其反应体系成分组成为： 终浓度为0.2～0.6 μM的正向引物 F， 终浓度为0.2说　明　书 1/8 页 3 CN 114438263 A 3