(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210164196.2 (22)申请日 2022.02.22 (71)申请人 深圳市研元生物科技有限公司 地址 518125 广东省深圳市宝安区航城街 道三围社区航城大道159号航城创新 创业园A4栋 3A10 (72)发明人 龚正华　唐敏　夏震遥　卢甜　 (74)专利代理 机构 北京棘龙知识产权代理有限 公司 11740 专利代理师 刘传勇 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/46(2006.01) (54)发明名称 检测肺炎链球菌的RPA方法、 其专用引物和 探针及用途 (57)摘要 本发明公开了一种检测肺炎链球菌的RPA方 法、 其专用引物、 探针和用途， 其专用引物和探针 是基于肺炎链球菌特异性保守序列设计的， 具有 SEQ ID NO.2、 SEQ  ID NO.3、 SEQ  ID NO.4所示的 寡核苷酸序列。 本发明首次将新型恒温扩增技术 RPA应用于肺炎链球菌的检测中， 该方法模拟体 内DNA复制的酶反应过程， 依赖特定的酶和蛋白 组合， 包括重组酶、 单链结合蛋白和DNA聚合酶， 对DNA模板进行扩增， 可在37℃的恒温下实现特 定核酸序列的扩增， 扩增产物可通过侧向层析核 酸试检测纸条 实现可视化判别。 本发 明建立的检 测方法灵敏度可达10拷贝数/μL， 特异性高， 对 硬件设备的要 求很低， 且可在30min内完成检测， 无需对样品进行复杂处理、 适合现场检测， 适于 推广应用。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图2页 CN 114480689 A 2022.05.13 CN 114480689 A 1.一种基于RPA检测肺炎链球菌的非诊断方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1.以待测样品基因组DNA为模板， 在引物组和探针的标记下进行RPA反应； 所述引物组 和探针均是根据 肺炎链球菌特异 性保守序列设计的， 所述肺炎链球菌特异 性保守序列具有 SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列， 所述引物组中的正向引物具有SEQ  ID NO.2所示的寡核苷 酸序列， 反向引物具有SEQ  ID NO.3所示的寡核苷酸序列， 且5 ’端标记生物素； 所述探针具 有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列， 且5 ’端标记荧光素， 3 ’端添加延伸阻断基团， 在第34 ‑ 35位碱基之间增 加一个四氢呋喃； S2.用上述侧向层析核酸检测试纸条对回收后的RPA产物进行检测， 检测线和质控线均 显出， 判断结果为阳性结果； 检测线 未显出， 质控线显出， 判断结果为阴性结果； 质控线 未显 出， 不管检测线是否 显出， 均判定结果无效。 2.根据权利要求1所述的基于RPA检测肺炎链球菌的非诊断方法， 其特征在于， 所述的 荧光素为羧基荧光素FAM或FITC荧 光素， 所述的延伸阻断基团为磷酸基团。 3.根据权利要求1所述的基于RPA检测肺炎链球菌的非诊断方法， 其特征在于， 所述的 探针长度为 49bp， 其中5 ’端34bp， 3 ’端15bp。 4.根据权利 要求1所述的基于RPA检测肺炎链球菌的非诊断方法， 其特征在于， S1中， 将 引物组和探针用于50 μL的RPA反应体系进行RPA反应， 所述的正向引物的浓度为10 μmol/L， 反向引物的浓度为5 μmol/L， 所述的探针的浓度为10 μmol/L、 镁离子浓度280 μmol/L， 模板加 样量为1μL； 将2.1μL正向引物、 2.1μL反向引物、 0.6μL探针、 1μL样品、 12.2μL无DNase和 RNase水和29.5μL缓冲液组成预混液， 加到含有冻干酶粉的0.2mL的TwistAmp  nfo反应管 中， 然后将2.5 μL的醋酸镁溶液加到反应管的盖子上； 将反应管盖子上的醋酸镁溶液甩下， 充分混匀后37℃扩增20min， 在反应第4min， 将反应管取出充分混匀， 之后放回反应装置中 继续扩增； S2中， 检测时加样量 为5 μL， 试纸条显色时间控制在3 ‑5min。 5.一种用于检测检测肺炎链球菌的试剂 盒， 其特征在于， 包括引物组和探针； 所述引物 组和探针均是根据肺炎链球菌特异 性保守序列设计的， 所述肺炎链球菌特异 性保守序列具 有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列， 所述引物组中的正向引物具有SEQ  ID NO.2所示的寡核 苷酸序列， 反向引物具有SEQ  ID NO.3所示的寡核苷酸序列， 且5 ’端标记生物素； 所述探针 具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列， 且5 ’端标记荧光素， 3 ’端添加延伸阻断基团， 在第 34‑35位碱基之间增 加一个四氢呋喃。 6.一种用于检测肺炎链球菌的RPA专用引物， 其特征在于， 其是根据肺炎链球菌特异性 保守序列设计的， 所述肺炎链球菌特异 性保守序列具有SEQ  ID NO.1所示的核苷 酸序列； 所 述引物中的正向引物具有SEQ  ID NO.2所示的寡核苷酸序列， 反向引物具有SEQ  ID NO.3所 示的寡核苷酸序列， 且5 ’端标记生物素。 7.一种用于检测肺炎链球菌的RPA探针， 其特征在于， 其是根据肺炎链球菌特异性保守 序列设计的， 所述肺炎链球菌特异性保守序列具有SEQ  ID NO.1所示的核苷 酸序列； 该探针 具有SEQ ID NO.4所示的寡核苷酸序列， 且5 ’端标记荧光素， 3 ’端添加延伸阻断基团， 在第 34‑35位碱基之间增 加一个四氢呋喃。 8.权利要求5所述的试剂盒用于检测肺炎链球菌的非诊断用途。 9.权利要求6所述的RPA 专用引物用于检测肺炎链球菌的非诊断用途。 10.权利要求7 所述的RPA探针用于检测肺炎链球菌的非诊断用途。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480689 A 2检测肺炎链球菌的R PA方法、 其专用引物和探针及用途 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 涉及肺炎链球菌 的分子生物学， 涉及一种检测肺炎链 球菌的方法及其用途， 特别 涉及一种利用重组酶聚合酶恒温扩增技术(RPA技术)快速检测 肺炎链球菌的方法、 其专用引物和探针及其用途。 背景技术 [0002]苛养菌是社区感染最常见的病原菌， 可引发菌血症、 脑膜炎、 肺炎等严重侵袭性疾 病， 在儿童等免疫力低下 的人群中尤为严重。 感染初期及早合理的使用抗菌药物对其治疗 和预后都非常重要。 然而， 由于苛养菌的分离鉴定耗时长， 对培养环境要求严 苛且极易受到 实验室、 人员及技术差异限制， 因而严重影响了苛养菌感染者的诊断， 延迟了临床患者的治 疗时机。 而肺炎链球菌是其中占比最大的一类。 本专利提出了一种基于RPA 技术的肺炎链球 菌检验方法， 对肺炎链球菌进 行快速、 高效且准确的检出； 有助于对肺炎链球菌感染病情的 判断， 抗菌药物用药指导； 并能有效缩短诊断及检出时间， 节约检出成本， 具有重大的临床 意义和社会经济价 值。 [0003]苛养菌是对营养要求严苛， 在普通培养基中难以生长或不生长， 在体外培养过程 中需加入特殊因子或其他营养成分方可缓慢生长的一类细菌， 主要包括肺炎链球菌、 流感 嗜血杆菌、 卡他莫拉菌、 脑膜炎奈瑟菌、 军团菌及鲍特菌等。 临床常见的苛养菌多数是人类 呼吸道的正常菌群或寄居菌， 在人体免疫力正常时不致病， 但在机体免疫力不 足的情况下， 如儿童患者或免疫抑制时， 苛养菌可能导致严重的呼吸系统炎症， 或进入循环系统引起其 他部位的感染。 研究显示， 在儿童的感染性疾病中， 苛养菌是一类重要的致病菌， 它不仅能 引起呼吸道的感染， 还可引起中耳炎、 败血症、 脑膜炎等。 在儿童患者中， 苛养菌检出率及耐 药率均显著高于成年人。 且在苛养菌检出阳性标本中， 呼吸道感染标本占90％。 因此， 在对 患者的临床检验中， 更应注重儿童患者呼吸道苛养 菌的检出情况。 [0004]呼吸道感染主要可分为上呼吸道感染和下呼吸道感染两种类型， 病毒与细菌为上 呼吸道感染主要病原体， 而真菌、 支原体、 病毒及细菌为导致下呼吸道感染主要因素。 针对 该类病症诊治， 首要条件即为临床检验中对病原菌的精确判定， 提高用药合理性并对耐药 发展产生一定延缓作用。 在当前 的临床检验中， 呼吸道病原菌的分离与鉴定仍是感染患者 诊断的金标准。 然而， 苛养菌在培养中对营养和环境等因素要求极高， 且由于各实验室在环 境、 人员配置及技术上存在差异， 采用常规细菌培养方法时很容易漏诊， 导致 苛养菌整体检 出率仅有20％ ‑60％。 在临床上， 由苛养菌引起的感染很难精确的诊断和治疗， 造成了抗菌 药物不合理使用， 并贻 误了患者最佳治疗时机。 如以重度肺部感染为例， 先明确病原菌方可 选取适宜抗菌药品， 将耐药产生风险降低。 在现阶段 临床中， 针对病原学诊断的重要价值并 未予以足够重视， 多以经验性诊治为主， 病因模糊 诊断如不明原因肺炎及慢性肺炎等较为 常见， 微生物检测能力与临床需求脱节现象较为普遍。 以肺炎链球菌为例， 典型形态为隆 起， 湿润， 脐 窝状， 草绿色溶血， 与链球菌属其它细菌难以区分； 流感嗜血杆菌形态为露滴状 小菌落， 不溶血且无色透明， 与奈瑟菌相 近。 然而据报道， 在苛养菌的分离鉴定中使用来源说　明　书 1/8 页 3 CN 1