(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210170861.9 (22)申请日 2022.02.23 (71)申请人 中国农业科 学院油料作物研究所 地址 430062 湖北省武汉市武昌区徐 东二 路2号 申请人 南昌大学　 天筛 （上海） 科技有限公司 (72)发明人 高鸿飞　翟杉杉　吴刚　郑云曦　 武玉花　杨瑶　汤敏　张凡　 王继国　 (74)专利代理 机构 北京市诚辉律师事务所 11430 专利代理师 范盈　李玉娜 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12M 1/00(2006.01) C12M 1/34(2006.01) C12M 1/36(2006.01) (54)发明名称 一种植物免提取直接实时荧光快速PCR扩增 稳定剂、 PCR扩增组合物和PCR扩增方法 (57)摘要 本发明提供一种植物免提取直接实时荧光 快速PCR扩增稳定剂、 PCR扩增组合物和PCR扩增 方法， 具体公开了一种植物免提取PCR反应的稳 定剂， 所述稳定剂包括MgCl2、 牛血清白蛋白、 吐 温20和甜菜碱。 还公开了一种植物免提取的PCR 反应组合物， 所述PCR反应组合物包含快速扩增 组合物、 正向引物、 反向引物、 探针、 所述植物免 提取PCR反应的稳定剂。 本发明直接以植物叶片 作为模板， 无需破碎组织以及提取基因组DNA繁 琐步骤和装置， 与其它植物基因组DNA快速提取 技术相比， 无需PCR扩增前预处理。 使得整个分析 过程显著简化PCR分析流程、 缩短分析时间， 有利 于分子育种中单株叶片高效检测以及作物品系 现场快速鉴定 。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图5页 CN 114959090 A 2022.08.30 CN 114959090 A 1.一种植物免提取PCR反应的稳定剂， 其特征在于， 所述稳定剂包括MgCl2、 牛血清白蛋 白、 吐温20和甜菜碱 。 2.根据权利要求1所述的稳定剂， 其特征在于， 所述稳定剂中各组分的浓度为0.6 ‑ 1.0mM的MgCl2、 0.6‑1.0mM的牛血清白蛋白、 0.08％ ‑0.12％的吐温20和0.4 ‑0.6mM的甜菜 碱； 其中0.08％ ‑0.12％吐温20为质量浓度百分比。 3.根据权利要求1所述的稳定剂， 其特征在于， 所述稳定剂中各组分的浓度为0.8mM   MgCl2、 0.8mM牛 血清白蛋白、 0.1％吐温20和0.5mM甜菜碱 。 4.一种植物免提取的PCR反应组合物， 其特征在于， 所述PCR反应组合物包含快速扩增 组合物25 μL、 正向引物2 μL、 反向引物2 μL、 探针1 μL、 权利要求1 ‑3任一项所述植物免提取PCR 反应的稳定剂20 μL， PCR反应组合物为5 0 μL； 快速扩增组合物包含0.4mM  dNTPs、 0.4mM  dUTP、 5mM Mg2+、 DNA聚合 酶和尿嘧啶DNA糖基 化酶。 5.权利要求4所述的PCR反应组合物， 其特征在于， 所述的探针的标记物质为5 ’端修饰 Hex和3’端修饰BHQ1。 6.一种植物免提取PCR的反应试剂盒， 其特征在于， 所述反应试剂盒包含权利要求1或5 所述的植物免提取的PCR反应组合物。 7.权利要求4或5所述的植物免提取的PCR反应组合物或权利要求6所述的植物免提取 PCR的反应试剂盒在进行植物PCR中的应用， 所述的植物PCR以未 经DNA提取的植物部分。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述的植物部分为植物叶片、 植物种子、 植 物胚芽。 9.一种植物免提取的PCR反应装置， 其特征在于， 所述PCR反应装置包含权利要求6所述 的反应试剂盒、 PCR检测仪； 优选地， PCR检测仪 选自便携式快速扩增PCR仪、 实时荧 光定量PCR仪器。 10.一种植物免提取PCR检测方法， 其特 征在于， 其包括以下步骤： 1)取未处理的植物部分， 放入权利要求1 ‑3任一项所述的PCR反应组合物中； 2)进行实时荧 光PCR快速扩增； 优选地， 植物部分选自植物叶片、 植物种子、 植物胚芽； 优选地， PCR体系包括快速扩增组合物5μL、 引物 ‑F 2 μL、 引物 ‑R 2 μL、 探针1μL、 稳定剂 20 μL， PCR体系为5 0 μL； 优选地， 其中稳定剂含有终浓度为0.8mM  MgCl2、 0.8mM BSA、 0.1％吐温 ‑20和0.5mM甜菜 碱的水溶液。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959090 A 2一种植物免提取直接实时荧光快速PCR扩增稳定剂、 PCR扩增 组合物和PCR扩增方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学检测领域， 具体涉及植物叶片组织直接快速PCR扩增的方 法。 背景技术 [0002]对于一些成熟的分子育种作物目前正在加速产业化应用。 而这些优良的转基因品 系一旦被批准商业化种植， 目前已有的基于蛋白的现场快速检测 技术将难以适用， 迫切需 要建立能够鉴定转基因品系的外源核酸快速分析技术以满足转基因产业化后对于作物田 间现场检测的监管需求。 [0003]传统PCR扩增技术包括核酸提取、 扩增和检测。 核酸提取主要有试剂法(如CTAB法、 SDS法)、 核酸提取试剂盒法等。 然而这些方法常常涉及核酸抽提、 沉淀、 洗脱等多个操作步 骤， 数个小时提取时间以及依赖离心机等大型仪器等， 并且试剂法需要用到氯仿等有毒试 剂， 而试剂盒提取成本较高。 因此， 传统的核酸提取方法不利于大量样品的分析和检测， 难 以满足建立在核酸分析基础上开展的大规模现场快速检测分析的要求。 PCR扩增是目前应 用最为成熟的技术， 然而PCR扩增需要较长的反应时间。 核酸恒温扩增技术如LAMP、 RPA虽然 可以实现核酸快速扩增， 然而该类技术的应用研究仍处于起步阶段， 在实际应用中存在成 本高昂、 引物设计复杂或易产生假阳性问题等不 足。 扩增产 物可以结合多种方法进 行检测， 如凝胶电泳、 核酸试纸条、 实时荧光等。 凝胶电泳检测繁琐耗时。 核酸试纸条可以实现快速、 便捷分析， 然而由于引物二聚体和气溶胶污染， 容易产生假阳性结果。 实时荧光分析可以实 现扩增产物准确分析以及定量分析， 扩增反应完成即可读出 结果， 有效缩短检测时间。 [0004]随着分子标记辅助选择技术在农作物分子育种中的广泛应用， 在进行遗传连锁 分 析时， 需要对大量单株叶片组织进行PCR扩增以进行分子鉴定。 按照现有DNA分子标记检测 流程： 在实验室工作中首先要分株提取待测植物叶片DNA， 确 定DNA浓度进行相应PCR扩增， 最后进行凝胶电泳检测， 此外在田间育种材料的选择中， 也需要 大量提取待测植株叶片DNA 以进行目标基因的标记跟踪。 至少数百株植物叶片的基因组DNA的提取工作 异常繁琐耗时， 消耗大量人力和物力成本 。 [0005]现有技术中已有一些相关技术， 例如， 专利CN  101575597A、 CN  103289991  A、 CN  101812445 A提供了植物组织基因组快速提取技术， 但 这些技术需要裂解、 中和和沉淀等核 酸提取步骤或破碎装置。 专利CN  111254188  A提供了动物组织直接PCR扩增技术， 但该技术 在PCR扩增前需要样品预处理操作。 虽然目前已有少数公开专利如植物 叶片直接PCR扩增 (CN 112813150  A、 CN 109680089  A)以及种子发芽直接PCR扩增(CN  109234372  A)， 然而这 类方法均采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测， 需要耗费大量人力和物力成 本， 无法进行 快速鉴定， 不利于 批量试验。说　明　书 1/8 页 3 CN 114959090 A 3