(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210166250.7 (22)申请日 2022.02.23 (71)申请人 赣南师范大学 地址 341000 江西省赣州市 蓉江新区师 大 南路 (72)发明人 黄爱军　王莹　易龙　 (74)专利代理 机构 焦作加贝专利代理事务所 (普通合伙) 41182 代理人 任昕 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 西番莲病毒的组合引物对及多重RT-PCR检 测方法 (57)摘要 本发明提供了一种西番莲病毒的组合引物 对及多重RT ‑PCR检测方法， 该检测方法包括： 提 取待检样品的RNA， 以此为模板进行多重RT ‑PCR 反应。 在反应体系中， 需加入西番莲病毒的组合 引物对、 缓冲液、 酶、 RNA模板和双蒸水， 设定反应 程序， 进行反应。 反应完成后， 取出反应物， 与核 酸上样缓冲液按照产物： 缓冲液=3:1比例混合均 匀， 点入琼脂糖凝胶孔中电泳， 通过凝胶成像仪 观察结果。 本发 明提供了一组用于同时鉴定西 番 莲东亚西番莲病毒、 夜来香花叶病毒、 西番莲潜 隐病毒和柑橘弹状病毒四种病毒的特异性引物， 及一种基于多重RT ‑PCR技术快速检测鉴定这四 种病毒的方法， 该方法方便快捷、 一个反应可同 时检测四种 病毒， 适于 推广应用。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 CN 114292964 A 2022.04.08 CN 114292964 A 1.一种西番莲病 毒的组合引物对， 其特征在于： 所述西番莲病 毒包括东亚西番莲病 毒、 夜来香花叶病毒、 西番莲潜隐病毒和柑橘弹状病毒； 所述东亚西番莲病毒的上游引物如： GAATGGTCACAACCCCAAC， 下游引物如： TATCTAGGCATATACG GCTCT； 所述夜来香花叶病毒的上游引物如： GAATTGGATAGACAAGCCAT， 下游引物如： CCACCTTTACGAATTCATTG； 所述柑橘弹状病毒的上游引物如： ATATTCACCCCGATAACCAAGG， 下游引物如： GACACCCTGATAGA ATCGAG； 所述西番莲潜隐病毒的上游引物如： ATGCAAACAATGGGTAAGCA， 下游引物如： TCGTTAAATTGCGAATACGG。 2.一种西番莲病毒的多重RT ‑PCR检测方法： 其特 征在于： 其包括如下步骤： （1） 、 提取待检西番莲 植物的总RNA； （2） 、 在多重RT ‑PCR反应体系中， 加入如权利要求1所述的组合引物对、 缓冲液、 双蒸水、 酶和RNA模板， 然后设定反应程序； （3） 、 反应完成后， 取出反应物， 与上样缓冲液混合均匀， 点入琼脂糖凝胶孔中电泳， 在 凝胶成像仪上观察结果。 3.根据权利要求2所述的西番莲病毒的多重RT ‑PCR检测方法： 其特征在于： 步骤 （1） 中， 所述西番莲病毒包括 东亚西番莲病毒、 夜来 香花叶病毒、 西番莲潜隐病毒和柑橘弹状病毒。 4.根据权利要求2所述的西番莲病毒的多重RT ‑PCR检测方法： 其特征在于： 步骤 （2） 中， 所述组合引物对包括东亚西番莲病毒的上游引物如： GAATGGTCACAACCCCAAC， 下游引物如： TATCTAGGCATATACG GCTCT； 夜来香花叶病毒的上游引物如： GAATTGGATAGACAAGCCAT， 下游引物如： CCACCTTTACGAATTCATTG； 柑橘弹状病毒的上游引物如： ATATTCACCCCGATAACCAAGG， 下游引物如： GACACCCTGATAGA ATCGAG； 西番莲潜隐病毒的上游引物如： ATGCAAACAATGGGTAAGCA， 下游引物如： TCGTTAAATTGCGAATACGG。 5.根据权利要求2所述的西番莲病毒的多重RT ‑PCR检测方法： 其特征在于： 步骤 （2） 中， 所述反应程序为： 50℃， 孵育30  min， 94℃预变性4  min， 94℃变性2 0 s， 56℃退火2 0 s， 72℃ 延伸1 min， 35个循环， 72℃再延伸7  min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114292964 A 2西番莲病毒 的组合引物对及多重RT ‑PCR检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于检测技术领域， 具体涉及一种西番莲病毒的组合引物对及多重 RT‑PCR 检测方法。 背景技术 [0002]西番莲又名百香果， 广泛种植于热带和亚热带地区， 在我国广东、 广西、 福建、 江 西、 贵州、 云南等省份均有栽培。 西番莲果实含有130多种芳香类物质， 香 味独特， 富含维生 素C、 类胡萝卜素、 花青素等， 营养价值高， 当年种植即可挂果， 挂果寿命 可达10年， 是一种经 济效益相当可观的热带作物。 病毒病是西番莲种植过程中影响其经济价值的重要因素之 一， 目前西番莲上已报道的病毒种类超过30种。 东亚西番莲病毒(East  Asian Passiflora   virus,EAPV)、 夜来香花叶病毒(Telosma  mosaic virus,TeMV)、 西番莲潜隐病毒 (Passiflora  latent virus ,PLV)和柑橘弹状病毒(Citrus ‑associated   cytorhabdovirus,CiaRV)是田间常见的4种病毒。 EAPV是西番莲石果病的病原之一， 可引起 果实果皮变厚变硬， 果肉少或无， 果实风味变差； TeMV单独感染西番莲可引起植株叶片黄 化、 花叶， 皱缩、 畸形的症状， 整株树势变弱； PLV单独感染植株可在叶片上引起系统的花叶 症状； CiaRV感染植株可能与植株叶片的花叶和黄化症状相关。 这4种病毒在田间经常两种、 三种甚至四种混合侵染， 而混合侵染可能会在寄主上引起更剧烈的症状。 针对这些病毒病 害， 并无有效的化学药剂可以达到治疗的效果。 现在生产上针对病毒病害的防控主要是通 过清除田间病树、 种植无病毒苗木和切断传播途径来防控， 而这些防控措施的实施， 需要准 确、 灵敏、 快速的检测方法作为基础。 针对这四种病毒， 已经建立了单重聚合酶链式反应 (Polymerase  chain reaction,PCR)检测方法， TeMV以成功制备多克隆抗体， 可用于单种病 毒的快速检测。 多重P CR是在常规P CR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术， 即在 同一个反应中加入两对以上的引物， 同时在同一个模板或不同模板之 间进行多个核酸片段 的扩增。 与常规PCR相比， 多重PCR技术拥有单个PCR的灵敏和特异性， 又更加快捷、 经济、 增 加了检测的通量， 已应用于多种植物、 动物病原检测中。 反转录聚合酶链式反应(Reverse   Transcription –Polymerase  chain reaction,RT ‑PCR)是PCR技术应用的变形， 先将RNA转 录成cDNA， 再以cDNA为模板， 在DNA聚合 酶的作用下扩增合 成目的片段， 广泛应用于RNA病毒 的检测中。 目前针对西番莲中以上四种 病毒还未建立多重RT ‑PCR检测方法。 发明内容 [0003]针对现有技术中的不足， 本发明的目的是提供一种西番莲病毒的组合引物对及多 重RT‑PCR检测方法。 本发明根据TeMV的外 壳蛋白基因(coat  protein,CP)区域、 EAPV的VPg 基因区域、 CiaRV的N基因区域特设计3对 特异性的扩增引物， PLV的引物找 寻于文献中， 利用 一步法多重RT ‑PCR技术， [0004]为达到上述目的， 本发明的解决方案是： [0005]一种检测西番莲病毒的组合引物对， 其特征在于： 所述西番莲病毒包括EAPV、说　明　书 1/4 页 3 CN 114292964 A 3