(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210170358.3 (22)申请日 2022.02.23 (71)申请人 南方医科 大学南方医院 地址 510515 广东省广州市白云区广州大 道北1838号 (72)发明人 张忠民　李鹏　费成硕　陈彦霖　 王亮　 (74)专利代理 机构 广州京诺知识产权代理有限 公司 44407 专利代理师 吴嘉滨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 黄韧带肥厚早期诊断用miRNA生物标志物、 试剂盒及应用 (57)摘要 本发明提供一种黄韧带肥厚早期诊断用 miRNA生物标志物、 试剂盒及应用， miRNA生物标 志物为miR ‑10396b ‑3p， 具体序列如下： GGCCCCGGGCCCUCGACCGGAC； miRNA生物标志物为 血浆miRNA生物标志物 。 并采用上述miRNA生物标 志物、 外周血单核粒细胞提取试剂、 总RNA提取试 剂以及RT ‑PCR引物制成试剂盒， 该试剂盒用于早 期诊断黄韧带肥厚。 本发明的有益效果在于： 本 发明首次发现了对黄韧带肥厚具有较高诊断价 值的生物标志物miR ‑10396b‑3p； 通过检测血浆 miR‑10396b‑3p和研制相关试剂盒， 可以使黄韧 带肥厚的筛查和早期诊断方便易行， 为临床医生 快速掌握病情提供帮助， 同时也为可疑黄韧带肥 厚同时伴有MRI检查禁忌人群， 提供了一种经济、 安全的检测手段。 权利要求书1页 说明书7页 附图6页 CN 115141882 A 2022.10.04 CN 115141882 A 1.一种黄韧带肥厚早期诊断用miRNA生物标志物， 其特征在于， 所述miRNA生物标志物 为miR‑10396b‑3p， 具体序列如下： GGCCCCGGGCCCUCGACCGGAC； 所述miRNA生物标志 物为血浆miRNA生物标志 物。 2.根据权利要求1所述的黄韧带肥厚早期诊断用miRNA生物标志物， 其特征在于， 所述 miRNA生物标志 物在血浆中的表达水平与黄韧带 肥厚程度呈负相关。 3.一种黄韧带肥厚早期诊断用试剂盒， 其特征在于， 包括如权利要求1~2任一项所述的 miR‑10396b‑3p标准品、 外周血单核粒细胞提取试剂、 总RNA提取试剂以及对miR ‑10396b‑3p 具有检测特异性的RT ‑PCR引物。 4.根据权利 要求3所述的黄韧带肥厚早期诊断用试剂盒， 其特征在于， 所述RT ‑PCR引物 包括： miR‑10396b‑3p F： 5’  ACACTCCAGCTGGGGGCCCCGGGCCCTCGACC； miR‑10396b‑3p R： 5’CTCAACTGGTGTCGTG GA； miR‑10396b‑3p RT： 5’  CTCAACTGGTGTCGTG GAGTCGGCAATTCAGTTGAGGTCCGGTCG。 5.一种根据权利要求4所述的黄韧带肥厚早期诊断用试剂盒， 其特征在于， 用于检测 miRNA表达量的方法为RT ‑PCR方法。 6.一种根据权利要求4所述的黄韧带肥厚早期诊断用试剂 盒的应用， 其特征在于， 所述 试剂盒用于 黄韧带肥厚早期诊断。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115141882 A 2黄韧带肥厚早期诊断用miRNA生物标志物、 试剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物检测领域， 特别是涉及一种黄韧带肥厚早期诊 断用miRNA生物标 志物、 试剂盒及应用。 背景技术 [0002]黄韧带肥厚(Ligamentum  flavum hypertroph y,LFH)是一种常见的脊柱退行性疾 病， 常发生于腰椎椎管。 增生肥厚的黄韧带压 迫神经根、 马尾神经， 引起患者下肢运动、 大小 便功能障碍， 严重危害人类的身心健康(Sakai  Y,Ito S,Hida T,Ito K,Harada  A, Watanabe  K.Clinical  out come of lumbar spinal stenosis  based on new  classification  according  to hypertrophied  ligamentum  flavum[J].J  Orthop  Sci.2017,22:27 ‑33)。 黄韧带肥厚起病隐匿、 无早期症状， 确 诊时往往已经造成神经受压。 目前诊断黄韧带肥厚， 只能采取MRI检查， 通过影像学测量黄韧带的厚度来判断病情(Kim   YU,Kong YG,Lee J,Cheong  Y,Kim SH,Kim HK,Park JY,Suh JH.Clinical  symptoms  of  lumbar spinal stenosis  as sociated  with morphological  parameter s on magnetic   resonance images[J].Eur  Spine J.2015,24:2236 ‑2243)。 然而， MRI检查费用昂贵、 扫描 耗时长， 对于体内有心脏支架、 金属植入物或罹患幽闭恐惧症的患者， 尚无法进行该项检 查。 因此， 为可疑黄韧带肥厚同时伴有MRI检查禁忌的人群， 寻找成本低廉、 快速有效的检测 技术， 具有极高的应用价 值和市场前 景。 [0003]随着高通量测序技术的快速发展， 基因测序逐渐从实验室走进临床， 大量的非编 码RNA的发现备受青睐。 miRNA(MicroRNA,微小核糖核酸)作为一种长约22nt的非编码RNA分 子， 参与调控 人体内超过1/3的基因表达过程， 其在生长发育、 免疫应答、 疾病转归等方面具 有广泛的作用(O'Connell  RM,Rao DS,Chaudhuri  AA,Baltimore  D.Physiological  and  pathological  roles for microRNAs  in the immune system[J].Nat  Rev  Immunol.2010,10(2):111 ‑122)。 现已证明， miRNA在进化上具有高度的保守性， 外周血 miRNA同组织miRNA具有一致的疾病特异性； 外周血中的miRNA性质稳定， 有望成为疾病发 生、 诊断和预后的重要候选标志物(Chen  Xu,Hao Zhang,Wenchao  Zhou,Huiqiao  Wu, Xiaolong  Shen,Yuanyuan  Chen,Mingfang  Liao,Yang  Liu,Wen Yuan.MicroRNA ‑10a,‑ 210,and ‑563as circulating  biomarkers  for ossification  of the posterior   longitudinal  ligament[J].Th e Spine Journal,2019,19(4):735 ‑743)。 目前提取外周血 miRNA， 主要通过分离血清或外泌体， 再进行检测。 该方法存在以下不足： ①血清中的miRNA 含量较低， 检测不易， 所需血样量大， 一次检测至少需要6 ml全血；②分离外泌体需要造价昂 贵的超速离心机， 目前仅限于大型实验室科研， 普通医院难以开展， 而且外泌体提取程序复 杂， 技术要求更高。 血浆是血液的重要组成部 分， 血细胞悬浮于其中， 因为mi RNA主要富集于 细胞核， 所以血浆中的mi RNA含量高于血清。 然而， 目前尚未有应用血浆mi RNA对黄韧带肥厚 早期诊断的相关研究， 若能筛选出黄韧带肥厚特异 性表达的血浆mi RNA作为生物标志物， 开 发出成本低廉、 快速有效的检测试剂盒,对黄韧带 肥厚的发病筛查具有重要意 义。说　明　书 1/7 页 3 CN 115141882 A 3