(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210166588.2 (22)申请日 2022.02.23 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 张椿雨　甘龙财　申继成　敦必成　 陈鹏　 (74)专利代理 机构 北京盛询知识产权代理有限 公司 11901 代理人 袁善民 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C07K 14/415(2006.01)C12Q 1/6895(2018.01) A01H 5/00(2018.01) A01H 6/20(2018.01) (54)发明名称 来源欧洲芜菁ECD04的BraA 08g039212 E基因 在根肿菌抗 性改良中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种来源欧洲芜菁ECD04的 BraA08g039212E基因在根肿菌抗性改良中的应 用， 本发明公开了来源于欧洲芜菁ECD04的 BraA08g039212E基因对中国根肿菌4号生理小种 的抗性作用， 该基因核苷酸序列如SEQ  ID No.1 或SEQ ID No.2所示， 氨基酸序列如SEQ  ID No.3 所示， 包括利用图位克隆法精细定位该基因， 明 确其在A08染色体上的物理位置， 然后利用该基 因的gDNA或cDNA进行克隆并遗传转化不抗根肿 病油菜， 从而验证该基因对根肿菌的抗根肿病功 能。 本发明可以为通过基因工程手段或分子标记 辅助选择技术选育芸薹属抗根肿病植物新品种 提供科学和技术依据。 权利要求书1页 说明书9页 序列表13页 附图15页 CN 114381463 A 2022.04.22 CN 114381463 A 1.BraA08g039212E基因在赋予根肿菌抗性中的应用， 其特征在于， 所述 BraA08g039212E基因的核苷酸序列如SEQ  ID No.1或SEQ  ID No.2所示， 其编码蛋白的氨 基 酸序列如SEQ  ID No.3所示。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述BraA08g039212E基因位于欧洲芜菁 ECD04的A08染色体上， 其物理位置为1486 3686‑14873201。 3.BraA08g039212E基因在根肿病抗病育种中的应用， 其特征在于， 所述 BraA08g039212E基因通过转基因或有性杂交转育途径用于芸薹属植物根肿病 抗病育种中 的应用， 所述芸薹属植物包括油菜、 白菜、 甘蓝或萝卜， 所述BraA08g039212E基因的核苷酸 序列如SEQ  ID No.1或SEQ ID No.2所示。 4.BraA08g039212E基因及根据其所开发的标记在芸薹属植物分子标记辅助选择中的 应用， 其特征在于， 所述芸薹属植物包括油菜、 白菜、 甘蓝或萝卜， 所述BraA08g039212E基因 的核苷酸序列如SEQ  ID No.1或SEQ ID No.2所示。 5.BraA08g039212E基因的启动子的用途， 其特征在于， 用于调控BraA08 g039212E基因 的表达， 其序列如SEQ  ID No.4所示。 6.一种用于扩增 BraA08g039212E基因全长的引物， 其特征在于， 包括如SEQ  ID No.5所 示的正向引物和SEQ  ID No.6所示的反向引物。 7.一种用于构建BraA08g039212E基因遗传转化载体的引物， 其特征在于， 包括如SEQ   ID No.7所示的正向引物和SEQ  ID No.8所示的反向引物。 8.一种用于BraA08g039212E基 因阳性检测的引物， 其特征在于， 包括SEQ  ID No.9所示 的正向引物和SEQ  ID No.10所示的反向引物。 9.一种用于检测BraA08g039212E基 因RT‑qPCR的引物， 其特征在于， 包括SEQ  ID No.11 所示的正向引物和SEQ  ID No.12所示的反向引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114381463 A 2来源欧洲芜菁EC D04的BraA08g039212E基因在根肿菌抗性改 良中的应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因克隆技术领域， 特别是涉及一种来源欧洲芜菁ECD04的 BraA08g0 39212E基因在根肿菌抗 性改良中的应用。 背景技术 [0002]根肿病是由芸苔根肿菌(Plasmodiophora  brassicae  Woronin)引起的一种土传 病害， 严重危害十字花科作物的生长发育。 根肿菌在土壤中以休眠孢子的形式存在， 萌发后 在寄主体内 以活体营养的方式进行繁殖， 使寄主植物生长素和细胞分裂素代谢紊乱， 导致 植物的根部肿大。 严重受到根肿菌侵染的植物， 其主根系可能被完全破坏， 从而影响地上部 分的生长发育， 造成植物的绝收。 油菜是我国重要的油料作物， 其产量深受根肿菌的影响。 根肿菌在国内主要分布于四川、 云南、 安徽、 湖北等省份。 随着 机械化程度不断提高， 根肿菌 扩散速度也不断加快， 已经严重影响到我国油菜产业的安全。 因此挖掘抗病基因， 利用抗病 位点去选育抗根肿病的优良油菜品种并解析根肿病的致病机理， 对于病情的管控、 稳定油 菜产量、 保证油菜产业 安全具有重大意 义。 [0003]目前， 欧洲芜菁是抗根肿病QTL或者主效基因的主要来源， 绝大多数抗病位点都分 布在A基因组染色体上， 分别为A 01染色体上的Crr2和PbBa1.1、 A02染色体上的CRc、 A03染色 体上的CRa和Crr3、 A06染色体上的Crr4。 在白菜品种 “Debra”的A02和A03染色体上分别定位 到了CRc和CRk。 2013年， Chen等利用欧洲芜菁ECD04作为供体亲本， 感病大白菜自交系C59 ‑1 作为受体亲本， 用4种不同的根肿菌生理小种(Pb2、 Pb4、 Pb7、 Pb10)对BC1F1世代部分材料进 行接菌鉴定， 同时结合已发表根肿病抗病基因相关特异性标记和SSR(Simple  sequence   repeat)， 利用QTL构建连锁遗传图谱， 分别在A01、 A03和A08染色体上一共定位出5个抗病位 点： PbBa1.1、 PbBa3.1、 PbBa3.2、 PbBa3.3和PbBa8.1(Chen  J,Jing J,Zhan Z,Zhang T, Zhang C,Piao Z.Identification  of novel QTLs for isolate ‑specific  partial  resistance  to Plasmodiophora  brassicae  in Brassica  rapa.PLoS  One,2013,8: e85307.)。 [0004]测序技术的发展对根肿菌抗病位点研究起到了一定的推进作用。 2019年， Huang等 利用转录组测序结合的混合分组分析技术(BSR ‑Seq)在抗根肿病芜菁品种 “Purple Top  White Globe”的A03染色体上定位到Rcr5抗根肿病位点， 并且将Rcr5的候选基因范围缩小 在8个基因内(Huang  Z,Peng G,Gossen  BD,Yu F.Fine mapping  of a clubroot   resistance  gene from turnip using SNP markers identified  from bulked  segregant RNA‑Seq.Mol Breeding,2019,39:131)。 [0005]目前为止， C Ra和Crr1是被克隆出来并且进行功能验证的两个根肿菌抗病基因。 抗 病基因CRa来自于ECD02中分离出一个抗病位点(Matsumoto  E,Ueno H,Aruga D,Sakamoto   K,Hayashida  N.Accumulation  of three clubroot  resistance  genes through marker‑ assisted  selection  in Chinese cabbage(Brassica  rapa ssp.pekinensis).J  Jpn Soc 说　明　书 1/9 页 3 CN 114381463 A 3