(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210166041.2 (22)申请日 2022.02.23 (83)生物保 藏信息 CGMCC No. 23074 2021.12.16 (71)申请人 中国农业科 学院生物技 术研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 申请人 三亚中国农业科 学院国家南繁 研究 院 (72)发明人 郎志宏　李圣彦　张杰　张明俊　 耿丽丽　李鹏程　 (74)专利代理 机构 北京兆君联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11333 专利代理师 胡敬红(51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 转基因玉米VP3C1外源插入片段的旁侧序列 及应用 (57)摘要 本发明涉及转基因玉米VP3C1外源插入片段 的旁侧序列及应用。 本发明从转Bt  vip3Aa‑m3基 因的玉米植株中筛选到一个抗草地贪夜蛾虫效 果显著的转基因事件VP3C1； 通过染色体步移 的 方法获得了其左边界旁侧序列和右边界旁侧序 列， 分别如SEQ  ID NO.1中第1 ‑756位所示和如 SEQ ID NO.2中第359 ‑932位所示， VP3C1外源片 段是双拷贝单位点反向插入， 在 玉米基因组上的 5’旁侧序列、 外源插入序列和3 ’旁侧序列如SEQ   ID NO.3所示。 两端的旁侧序列可以作为本转化 事件的特异 检测序列， 通过两个旁侧序列设计引 物， 可以对 转基因事件VP3C1特异性检测， 并应用 于检测试剂盒的开发。 权利要求书1页 说明书14页 序列表10页 附图4页 CN 114891909 A 2022.08.12 CN 114891909 A 1.转基因抗虫玉米VP3C1外源插入片段的5 ’端旁侧序列,如SEQ  ID NO.1中第1 ‑756位 所示。 2.转基因抗虫玉米VP3C1外源插入片段的3 ’端旁侧序列,如SEQ  ID NO.2中第359 ‑932 位所示。 3.根据权利要求1所述的5 ’端旁侧序列设计的PCR反应 检测用特异性引物。 4.根据权利要求3所述的5 ’端旁侧序列的特异性引物为： VP3C1‑Left‑F1： 5'‑GGCAAAGGACGGCAAAAGTA‑3'， VP3C1‑NOS‑R1： 5'‑TGAATCCTGTTGCCGGTCTT‑3'。 5.根据权利要求2所述的3 ’端旁侧序列设计的PCR反应 检测用特异性引物。 6.根据权利要求5所述的3 ’端旁侧序列的特异性引物为： VP3C1‑Ubi‑F1： 5’ ‑CCTGTTGTCAAAATACTCAATTGTCC‑3’， VP3C1‑Right‑R1： 5’ ‑CCTGTCATGTG GTTTGTGCA‑3’。 7.转基因抗虫玉米VP3C1的PCR反应检测方法， 其特征在于： 其PCR反应中的引物为权利 要求3‑6任一所述的特异性引物。 8.根据权利要求7 所述的PCR反应 检测方法， 其特 征在于： 所述的特异性引物为： VP3C1‑Left‑F1： 5'‑GGCAAAGGACGGCAAAAGTA‑3'， VP3C1‑NOS‑R1： 5'‑TGAATCCTGTTGCCGGTCTT‑3'， 转基因抗虫玉米VP3 C1得到的扩增片段 大小1067bp； 或者 VP3C1‑Ubi‑F1： 5’ ‑CCTGTTGTCAAAATACTCAATTGTCC‑3’， VP3C1‑Right‑R1： 5’ ‑CCTGTCATGTG GTTTGTGCA‑3’， 转基因抗虫玉米VP3 C1得到的扩增片段 大小为932bp。 9.一种检测抗虫玉米的试剂 盒， 其特征在于含有3或4所述的5 ’端旁侧序列的特异性引 物， 或/和含有权利要 要求5或6所述的3 ’端旁侧序列的特异性引物。 10.权利要求1或2所述的旁侧序列、 权利要求3 ‑6任一所述的旁侧序列的特异性引物、 权利要求9所述的检测抗虫玉米试剂盒在检测转基因玉米中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891909 A 2转基因玉米VP3C1外源插入片段的旁侧序列及应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技 术领域， 特别是 涉及转基因抗虫玉米植物及其检测。 背景技术 [0002]玉米(Zea  mays L.)原产于墨西哥一带， 俗称苞谷、 苞米等， 属于禾本科玉蜀黍属 (Gemus Zea)的一个重要亚种。 玉米是大宗粮食作物， 也是重要的饲料和工业原料。 近几年 来， 玉米的种植面积和产量逐渐超越水稻和小麦成为全国第一。 然而， 玉米虫害一直是制约 玉米产量的重要因素之一， 由于虫害的发生， 导致玉米严重减产， 甚至绝收， 造成巨大损失。 因此， 有效地防治虫害对我国乃至全世界的农业 生产具有非常重要的意 义。 [0003]虫害的防治方法有很多， 如物理防治、 化学防治、 生物防治、 农业防治等， 目前我国 大范围采取 的是化学防治方法， 即在植物生长过程中喷施化学杀虫剂。 但是农药 的过量喷 施所带来的一系 列环境问题尤为严重， 如土地污染、 农药残留、 害 虫抗药性和生态失衡等问 题， 同时农药的使用严重影响了食品安全。 上世纪90年代， 转基因技术的快速发展， 将外源 抗虫Bt基因转入玉米中， 培育出转基因抗虫玉米， 为虫害的防治提供了一条新的途径。 自 1996年第一例转Bt基因抗虫玉米在美国被批准商业化种植以来， 全球抗虫转基因玉米的种 植面积逐年增加， 主要选用的抗虫基因为cry1Ab、 cry1Ac、 cry9 C、 cry1F和vip3Aa20等， 抗虫 转基因玉米的应用对于害虫 的防控具有重要作用。 国内转Bt基因抗虫玉米起步较晚， 发展 相对缓慢， 尚未产业化， 需求紧迫。 目前多个国产Bt玉米产品获得生产应用安全证书， 为我 国Bt玉米的研发应用向前推进了一大步。 [0004]草地贪夜蛾(Spodoptera  frugiperda)属 鳞翅目夜蛾科灰翅夜蛾属， 是一种迁飞 性农业害 虫， 具有“国际性、 爆发性、 迁飞性和毁灭性 ”的特点， 其幼虫取食为害玉米， 严重发 生时可吃光玉米叶片， 造成玉米减产甚至绝收。 草地贪夜蛾源自美洲， 经由非洲传到亚洲， 其间对多种杀虫剂产生了抗性。 2018年12月， 草地贪夜蛾首次在云南省被发现， 2019年由南 向北推进， 入侵长江流域、 黄淮海流域及西北地区， 到2019年10月份已迁移扩散至26个省 份， 草地贪夜蛾发生面积达到106.5万公顷[吴秋琳， 姜玉英， 吴孔明.草地贪夜蛾缅甸虫源 迁入中国的路径分析[J].植物保护， 2019， 45(02):1 ‑6]。 草地贪夜蛾其迁飞能力特别强， 扩 散范围大， 繁殖能力强， 暴食危害重， 防控难度大， 对我国玉米产量造成严重损失。 草地贪夜 蛾的治理在国内研究得较少， 张磊等对入侵云南草地贪夜蛾进行分子鉴定发现入侵我国的 草地贪夜蛾均为 “玉米型”[张磊,靳明辉,张丹丹,等.入侵云南草地贪夜蛾的分子鉴定[J]. 植物保护,2019(2):7.]。 李国平等通过饲料表面涂抹法测定了草地贪夜蛾幼虫对Cry1Ab、 Cry1Ac、 Cry1F、 Cry2Ab以及Vip3A等5种Bt蛋白的敏 感性， 发现Vip3A蛋白对草地贪夜蛾致死 作用排在第一位[李国平,姬婷婕,孙小旭,等.入侵云南草地贪夜蛾种群对5种常用Bt 蛋白 的敏感性评价[J].植物保护,2019,45(3):6.]。 现有的研究表明， Vip3A蛋白对草地贪夜蛾 有较好的杀 虫效果。 [0005]在前期研究中将 来源于Bt  C9菌株的vip 3Aa11基因利用玉米偏 好密码子对该基因 进行密码子优化， 合 成新的基因命名为vip3Aa ‑m3基因， 构建植物表达载体转化玉米获得转说　明　书 1/14 页 3 CN 114891909 A 3