(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210169741.7 (22)申请日 2022.02.23 (71)申请人 中国农业科 学院油料作物研究所 地址 430062 湖北省武汉市武昌区徐 东二 路2号 申请人 南昌大学 (72)发明人 高鸿飞　翟杉杉　吴刚　武玉花　 李俊　郑云曦　汤敏　杨瑶　付伟　 (74)专利代理 机构 北京市诚辉律师事务所 11430 专利代理师 范盈　李玉娜 (51)Int.Cl. C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于快速直接二重PCR扩增的处理液、 扩增体系及试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种用于快速直接二重PCR扩增 的处理液、 扩增体系及试剂盒， 具体公开了用于 直接PCR扩增的预处理液， 所述的预处理液为含 有0.25mol/LNaOH和0.5mmol/L  Na2EDTA的 50mmol/L， pH8.0的Tris ‑HCl溶液， 并分别加入 BSA、 Tween  20和MgCl2·6H2O。 还公开了直接PCR 扩增的预处理液作为将植物种子或叶片预处理 为能够进行PCR直接扩增的唯一处理液的用途。 本发明中预处理液能够一步法完成植物种子等 组织中基因组DNA的提取， 并且本发明采用多重 荧光快速PCR检测， 进 一步提高分析准确度， 缩短 分析时间。 权利要求书2页 说明书16页 序列表8页 附图7页 CN 114958989 A 2022.08.30 CN 114958989 A 1.一种用于直接PCR扩增的预处理液， 其特征在于， 所述的预处理液为以体积比为1: 0.8‑1.2的pH为8.0  100mmol/L的Tris ‑HCl和pH为8.0含有0.5mol/L  NaOH的1.0mmol/L   Na2EDTA溶液混合， 并在每100mL混合溶液中分别加 入0.08g‑0.12g的BSA、 0.04mL ‑0.6mL的 Tween 20和0.35g‑0.45g的MgCl2·6H2O。 2.根据权利要求1所述的预处理液， 其特征在于， 所述的预处理液为以体积比为1:1的 pH为8.0 100mmol/L的Tris ‑HCl和pH为8.0含有0.50 mol/L NaOH的0.5 mmol/L Na2EDTA溶液 混合， 并在每100mL混合溶液中分别加入0.1g的BSA、 0.05mL的Tween  20和0.406g的MgCl2· 6H2O。 3.一种PCR多重扩增的组合物， 其特征在于， 每单位PCR多重扩增的组合物包括快速 qPCR Mix 10 μL； 外源基因和内参基因的上下游引物各10 μM， 探针10 μM； 权利要求1或2所述 的预处理液1 μL， d dH2O 7 μL； 优选地， 快速qPCR  Mix含有0.4mM的dA/ C/G/T/UTP、 5mM的Mg2+、 DNA聚合酶和UNG。 4.根据权利要求3所述的组合物， 其特征在于， 所述DNA聚合酶为具有5 ’到3’外切活性 的DNA聚合酶。 5.根据权利要求3或4所述的组合物， 其特征在于， 所述的PCR多重扩增体系用于检测含 有CaMV 35S启动子序列的玉米时， 所选择的外源基因上游引物为CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG   SEQ ID NO.13， 下游引物为TCTTGCGAAGGATAGTGGGATT  SEQ ID NO.14， 探针为 TCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCA  SEQ ID NO .15； 内参基因的上游引物为 CGGTGGATGCTAAGGCTGATG  SEQ ID NO.16； 下游引物为AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC  SEQ ID  NO.17； 探针序列为TA AGGAGCACTCGC CGCCGCATCTG SEQ ID NO.18； 所述的PCR多重扩增体系用于检测含有CaMV  35S启动子序列的水稻时， 所选择的外源 基因上游引物为CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG  SEQ ID NO .13， 下游引物为 TCTTGCGAAGGATAGTGGGATT  SEQ ID NO.14， 探针为TCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCA  SEQ ID  NO.15； 内参基因的上游引物为TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT  SEQ ID NO.31； 下游引物为 CTGATCCACTAGCAGGAGGTCC  SEQ ID NO.32； 探针序列为TGTTGTGCTGCCAATGTGGCCTG  SEQ ID  NO.33； 所述的PCR多重扩增体系用于检测含有T ‑NOS终止子序列的玉米时， 所选择的外源基因 上游引物为CATGTAATGCATGACGTTATTTATG  SEQ ID NO .40， 下游引物为 TTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGT  SEQ ID NO.41， 探针为ATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAA  SEQ  ID NO.42； 内参基因的上游引物为CGGTGGATGCTAAGGCTGATG  SEQ ID NO.16； 下游引物为 AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC  SEQ ID NO.17； 探针序列为TAA GGAGCACTCGCCGCCGCATCTG  SEQ  ID NO.18； 所述的PCR多重扩增体系用于检测含有T ‑NOS终止子序列的油菜时， 所选择的外源基因 上游引物为CATGTAATGCATGACGTTATTTATG  SEQ ID NO .40， 下游引物为 TTGTTTTCTATCGCGTATTAAATGT  SEQ ID NO.41， 探针为ATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAA  SEQ  ID NO.42； 内参基因的上游引物为GGCCAGGGCTTCCGTGAT  SEQ ID NO.43； 下游引物为 CCGTCGTTGTAGAACCATTGG  SEQ ID NO.44； 探针序列为AGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTGGTGCA   SEQ ID NO.45； 所述的PCR多重扩增体系用于检测瑞丰12 ‑5玉米种子时， 所选择的外源基因上游引物权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114958989 A 2为GTCGTTTCCCGCCTTCAGTT  SEQ ID NO.46， 下游引物为GGTGCCTGGAAGACAAGTTCTA  SEQ ID  NO.47， 探针为AGCTCAACCACATCGCCCGACGC  SEQ ID NO.48； 内参基因的上游引物为 CGGTGGATGCTAAGGCTGATG  SEQ ID NO.16； 下游引物为AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC  SEQ ID  NO.17； 探针序列为TA AGGAGCACTCGC CGCCGCATCTG SEQ ID NO.18。 6.一种直接PCR扩增的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中包含权利要求1或2所述的用 于直接PCR扩增的预处 理液和或权利要求3 ‑5任一项所述的PCR多重扩增的组合物。 7.一种现场快速鉴定系统， 其特征在于， 所述现场快速鉴定系统包括权利要求6所述的 直接PCR扩增的试剂盒； 优选地， 所述现场快速鉴定系统还 包含研磨仪、 离心机和PCR仪； 更优选地， 所述研磨仪为便携研磨仪， 所述离心机为便携式离心机， 所述PCR仪为小型 超速PCR仪 。 8.一种现场快速鉴定方法， 其特 征在于， 所述方法包括以下步骤： S1)组织预处理： 将植物组织与权利 要求1或2所述的预处理液加入研磨仪中研磨， 取上 清液即基因 组DNA模板； S2)多重荧光PCR快速扩增： 取上述基因组DNA模板作为PCR模板， 以权利要求3 ‑5任一项 所述的PCR多重扩增的组合物作为反应 体系进行多重荧 光实时PCR扩增； 优选地， S2)中PCR反应程序： 98℃预变性60s， 98℃ 变性6s， 60℃退火延伸8s， 40个循环， 40℃1s； 优选地， S1)中研磨时加入预处理液200～400μL； 研磨时间为25 ‑35s； 研磨后通过离心 分离上清， 离心速度为80 00转以上， 离心时间为2分钟； 优选地， 所述 植物组织选择植物种子或叶片； 优选地， 所述 植物组织中的植物选自玉米、 油菜、 水稻。 9.权利要求1或2所述的用于直接PCR扩增的预处理液、 权利要求3 ‑5任一项所述的PCR 多重扩增的组合物、 权利要求6所述的试剂盒、 权利要求7所述的现场快速鉴定系统在用于 现场快速鉴定中的用途； 优选地， 所述的现场快速鉴定为以未处理的植物种子或叶片为DNA来源， 在30分钟以内 获得鉴定结果的方法。 10.权利要求1 ‑2任一项所述的用于直接PCR扩增的预处理液作为将植物种子或叶片预 处理为能够进行PCR直接扩增的唯一处 理液的用途。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114958989 A 3