(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210165354.6 (22)申请日 2022.02.23 (71)申请人 河南科技大 学 地址 471000 河南省洛阳市洛龙区开元 大 道263号 (72)发明人 赵德辉　王春平　王黎明　庞玉辉　 董普辉　闫雪芳　李家创　 (74)专利代理 机构 洛阳华和知识产权代理事务 所(普通合伙) 4120 3 专利代理师 李世鹏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于KASP技术的检测小麦粒重相关基因的 标记引物及应用 (57)摘要 本发明涉及基于KASP技术的检测小麦粒重 相关基因的标记引物及应用， 属于分子遗传育种 技术领域， 本发明提供特异成套引物 Kasp‑ TraesCS1A02G045300.2 ， 利用所述引物进行小麦 千粒重TraesCS1A 02G045300.2 基因的检测， 人为 误差低， 分析通量高， 适用大量样本的检测。 本发 明 提 供 的 共 显 性 分 子 标 记 应 用 于 TraesCS1A02G045300.2 基因的转育， 对于加快利 用小麦千粒重 TraesCS1A02G045300.2 基因进行 遗传改良， 提高育种效率具有重要实 践意义。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图2页 CN 114480713 A 2022.05.13 CN 114480713 A 1.检测小麦粒重相关基因的KASP标记引物， 其特征在于： 所述小麦粒重相关基因为水 稻OsMKP1的同源TraesCS1A 02G045300.2 基因， 所述KASP标记引物为由引物1、 引物2和引物3 组成的成套引物； 所述引物1自5 ’端到3’端依次为标签序列A和SEQ  ID NO： 01的第22 ‑42位所示的单链 DNA； 所述引物2自5 ’端到3’端依次为标签序列B和SEQ  ID NO： 02的第22 ‑42位所示的单链 DNA； 所述引物3为SEQ  ID NO： 03所示的单链DNA。 2.根据权利 要求1所述的KASP标记引物， 其特征在于： 所述标签序列A为FAM荧光标签序 列， 其核苷 酸序列如SEQ  ID NO： 01的第1 ‑21位所示； 所述标签序列B为HEX荧光标签序列， 其 核苷酸序列如SEQ  ID NO： 02的第1 ‑21位所示。 3.一种检测小麦粒重相关基因的试剂盒， 所述试剂盒包含权利要求1所述的KASP标记 引物。 4.一种检测或辅助检测小麦 TraesCS1A02G045300.2 基因型的方法， 其特征在于： 包括 以下步骤： 步骤一、 提取待测小麦基因 组DNA； 步骤二、 以所述待测小麦基因 组DNA为模板， 采用成套引物进行PCR扩增， 得扩增产物； 所述成套引物由引物1、 引物2和引物3组成， 所述引物1的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 01 所示， 所述引物2的核苷酸序列如SEQ  ID NO： 02所示， 所述引物3的核苷酸序列如SEQ  ID  NO： 03所示； 步骤三、 将步骤二所得扩增产物进行荧光信号扫描， 采用Kluster  Caller软件对扫描 数据进行分析， 根据分析 结果进行基因分型。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于： 步骤三中 ， 按照如下确定小麦 TraesCS1A02G045300.2 基因型： 若待测小麦扩增产物的荧光信号数据经Kluster  Caller软 件分析呈现蓝色， 则小麦 TraesCS1A02G045300.2 基因型为TT； 若待测小麦扩增产物的荧光 信号数据经Kluster  Caller软件分析呈现红色， 则小麦 TraesCS1A02G045300.2 基因型为 CC； 若待测 小麦扩增的产物的荧光信 号数据经Kluster  Caller软件分析呈现绿色， 则小麦 TraesCS1A02G045 300.2基因型为TC 。 6.权利要求1或2所述的KASP标记引物、 权利要求3所述的试剂盒、 或权利要求4 ‑5任意 一种所述的方法在 如下 （A）‑（F） 任意 一种中的应用： （A） ： 用于检测小麦或小麦杂交后代的 TraesCS1A02G045 300.2基因； （B） ： 用于鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状； （C） ： 用于培育、 筛选或辅助筛选具有高或低千粒重性状的小麦单株、 株系、 品系或品 种； （D） ： 制备用于检测小麦或小麦杂交后代的 TraesCS1A02G045 300.2基因的产品； （E） ： 制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的千粒重性状的产品； （F） ： 制备用于培育、 筛选或辅助筛选具有高或低千粒重性状的小麦单株、 株系、 品系或 品种的产品。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480713 A 2基于KASP技术的检测小 麦粒重相关基因的标记引物及应用 技术领域 [0001]本发明属于分子遗传育种技术领域， 特别涉及千粒重相关基因高通量KASP （Kompetitive  Allele‑Specific PCR， 竞争性 等位基因特异性PCR） 标记开发及应用。 背景技术 [0002]小麦是全球种植面积最大的作物， 年种植面积约为2.2亿公顷， 约占世界耕地面积 的1/6， 年产量7亿吨以上， 仅次于玉米 （http://apps.fas.usda.gov/psdonline/ circulars/production.pdf） 。 全世界有43个国家， 35%～40%的人口以小麦为主食， 提高产 量是重要的育种目标。 小麦单产是一个复杂性状， 受各种直接和间接遗传因子调控， 可将其 表示为单位面积粒数和粒重的乘积， 而单位面积的粒数可分解为单位面积穗数和每穗粒 数。 每一项增加都可以提高单产， 但各因子相互制约， 只有协调发展穗数、 粒数、 粒重， 才能 达到高产。 不同年份育成品种的研究发现， 上世纪小麦单产的提高主要依赖于单位面积粒 数的增加 （Fischer  2008; Hawkesford  et al. 2013） 。 1980年以来， 粒重在产量提高方面 所起作用日益显现 （Calderini  and Ortiz‑Monasterio  2003; Sadras and Lawson  2011） 。 过去几十年里， 我国河南和山东小麦的产量潜力仍在继续增长， 穗粒数显著 提高， 其 中河南省的粒重也在明显增加 （Zheng  et al. 2011; Xiao et al. 2012; Gao et al.  2017） 。 粒重是产量构成的三个最重要性状之一， 其主要取决于籽粒大小、 形态和质地等因 子的共同遗传。 [0003]虽然已经定位很多粒重相关的QTL， 但其在育种中的应用却鲜有报道。 主要原因有 以下两点： （1） 与QTL连锁的标记距离基因太远， 不能对其进行准确 选择。 因此， 标记没有通 用性， 仅对与定位群体有关的材料有效 （Bagge  et al. 2007; Liu et al. 2012） ； （2） 普 通 小麦是经过多次杂交形成的异源六倍体， 具有ABD三个亚基因， 基因组既庞大又复杂 （Salamini  et al. 2002; Peng et al. 2011） ， 导致QT L精细定位和基因克隆比较困难。 比 较基因组学研究发现， 水稻与小麦的基因组之间， 大多 数位点上基因具有共线性 （Sorrells   et al. 2003） ， 已从小麦中克隆了 很多与粒重性状相关水稻同源基因并开发了功能标记。 [0004]Xu等 （2018） 揭示了OsMKP1在调控水稻籽粒大小上的作用。 OsMKP1丢失功能形成大 的籽粒， 而过表达OsMKP1导致籽粒变小。 进一步分析显示OsMKP1能够同OsMAPK6相互作用， 去磷酸化OsMAPK6， 导致且使其失活。 因此， 这些研究揭示了OsMKP1通过抑制MAPK信号途径， 决定籽粒大小的重要机制。 [0005]KASP标记已广泛应用于检测小麦、 水稻和玉米等作物的SNP位点 （Ertiro等， 2015； Chandra等， 2016； Steele等， 2018） ， 无需电泳， 可实现高通量基因分型。 利用小麦SNP芯片的 基因型数据进行QTL定位和全基因组关联分析， 将连锁SNP转化为KASP标记 （Liu等， 2016； Rasheed， 2016， 2017； Jia 2018； Fu等， 2020； Jiang等， 2021） ， 可直接应用于分子标记 辅助选 择育种。说　明　书 1/9 页 3 CN 114480713 A 3