(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210184285.3 (22)申请日 2022.02.23 (71)申请人 安徽省农业科 学院畜牧兽医研究所 地址 230000 安徽省合肥市农科南路40号 (72)发明人 戴银　李梅珍　殷冬冬　尹磊　 王洁茹　胡晓苗　赵瑞宏　沈学怀　 潘孝成　周学利　侯宏艳　张朝霞　 (74)专利代理 机构 合肥东邦滋原 专利代理事务 所(普通合伙) 3415 5 代理人 王天马 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种水禽细 小病毒、 鸭肠炎病毒及鹅星状病 毒的多重PCR检测引物组、 试剂盒和检测方法 (57)摘要 本发明涉及生物检测技术领域， 具体公开了 一种水禽细小病毒、 鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的 多重PCR检测引物组、 试剂盒和检测方法， 本发明 所述的多重PCR检测引物组、 试剂盒和检测方法， 是通过在一个PCR管内一次完成多重PCR扩增， 能 同时检测GPV、 MDPV、 DEV、 GAstV四种病毒， 且对鸭 坦布苏病毒、 番鸭呼肠孤病毒、 鸭III型肝炎病 毒、 鸭圆环病毒的检测为阴性， 检测灵敏度高、 特 异性强、 可重复性好， 大大提高了四种病毒的检 出效率； 同时利用该多重PCR反应体系进行检测， 可以有效节约PCR和电泳试剂、 实验耗材、 减少电 泳检测时间及成本 。 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 CN 114317835 A 2022.04.12 CN 114317835 A 1.一种水禽细小病毒、 鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物组， 其特征在于， 所述多重PCR检测引物组包括以下三组： (1)用于检测水禽细小病毒的引物组， 由GPV ‑MDPV‑F和GPV‑MDPV‑R组成的引物组， 其 中： GPV‑MDPV‑F的核苷酸序列为： 5’ ‑TGGAAGAAGGCAGTGAGT ‑3’； GPV‑MDPV‑R的核苷酸序列为： 5’ ‑AGGTCCGTAGAGC CATAT‑3’； (2)用于检测鸭肠炎病毒的引物组， 由DEV ‑F和DEV‑R组成的引物组， 其中： DEV‑F的核苷酸序列为： 5’ ‑CCAAGATACCAGTGATGC ‑3’； DEV‑R的核苷酸序列为： 5’ ‑ACCTACAATTCAGCAACG‑3’； (3)用于检测鹅星状病毒的引物组， 由GAst V‑F和GAstV‑R组成的引物组， 其中： GAstV‑F的核苷酸序列为： 5’ ‑TCATTACGAGCAG GAGAA‑3’； GAstV‑R的核苷酸序列为： 5’ ‑CTGCACCGCAACTTTAAA‑3’。 2.根据权利要求1所述的水禽细小病 毒、 鸭肠炎病 毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物 组， 其特征在于， 所述用于检测水禽细小病毒的引物组， 其检测靶标基因为Rep1基因， 引物 大小为746bp。 3.根据权利要求1所述的水禽细小病 毒、 鸭肠炎病 毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物 组， 其特征在于， 所述用于检测鸭肠炎病毒的引物组， 其检测靶标基因为UL54基因， 引物大 小为641bp。 4.根据权利要求1所述的水禽细小病 毒、 鸭肠炎病 毒及鹅星状病毒的多重PCR检测引物 组， 其特征在于， 所述用于检测鹅星状病毒的引物组， 其检测靶标基因为ORF1 a基因， 引物大 小为460bp。 5.一种根据权利要求1 ‑4任一项所述的水禽细小病毒、 鸭肠炎病毒及鹅星状病毒的多 重PCR检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 质粒标准品的制备及提取 S11、 取GPV和MDPV毒株、 DEV毒株、 GAstV毒株， 按照DNA/RNA提取试剂盒说明书提取核 酸， RNA样品按试剂盒说明书逆转录合 成cDNA第一链备用， 利用设计的三组引物， 进 行PCR扩 增； S12、 回收、 纯化PCR产物， 并连接至pUC57载体， 转化后构建pUC ‑GPV‑MDPV、 pUC ‑DEV、 pUC‑GAstV共三种重组质粒， 并将重组质粒菌液送至生工生物工程(南京)股份有限公司测 序鉴定； S13、 按照质 粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA， 采用核酸浓度测定仪测定质 粒DNA浓 度； S2、 多重PCR方法的建立权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114317835 A 2S21、 多重P CR反应体系： Premix  TaqTM 10 μL， 上游引物(20 μM)1 μL， 下游引物(20 μM)1 μL， DNA模板0.5 μL， ddH2O补充至20 μL； 设置退火温度分别为48℃、 49.2℃、 51.8℃、 53.2℃、 56.2 ℃、 58.8℃、 60℃； 设置GPV ‑MDPV、 GAstV、 DEV引物浓度比分别为1:4:5、 3:2:3、 5:1:1、 2:4:5、 4:5:2； S22、 通过优化， 筛选出多重PCR最适反应条件， 其中退火温度为56.2℃； GPV ‑MDPV、 GAstV、 DEV引物(20 μM)体积比为1:4:5； 反应体系为Premix  TaqTM 10 μL， 每种病毒模板0.5 μ L， ddH2O补至20 μL。 最佳扩增条件： 94℃预变性5min； 94℃变性30s， 56.2℃退火30s， 72℃延 伸90s， 共3 5个循环； 72℃终延伸10mi n。 6.一种根据权利要求5所述的水禽细小病毒、 鸭肠炎病 毒及鹅星状病 毒的多重PCR检测 试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括质粒标准品、 三组多重PCR检测引物组、 PCR试剂及多 重PCR反应 体系和最 适反应条件。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114317835 A 3