(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210172980.8 (22)申请日 2022.02.24 (71)申请人 杭州联川生物技 术股份有限公司 地址 310018 浙江省杭州市杭州经济技 术 开发区6号大街26 0号 (72)发明人 杨欢欢　 (74)专利代理 机构 杭州信与义专利代理有限公 司 33450 专利代理师 万景旺 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测肺癌多基因变异的引物、 探针、 试剂盒 及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种检测肺癌多基因变异的 引物、 探针、 试剂盒及其应用， 属于基因检测技术 领域。 其中， 所述多基因包括EGFR、 KRAS、 BRAF、 PIK3CA、 ERBB2、 ALK、 MET、 RET、 NTRK3、 NTRK1、 NTRK2和ROS1。 本发明的试剂盒检测样本类型丰 富， 所需样本量少， 含有内控系统， 能更加准确、 稳定地对样本进行检测， 确保结果真实可信； 检 测周期短， 2个小时就能完成检测。 可以连续检 测， 结果判读简单客观， 人为误差小， 重复性好、 操作简便， 可以实现自动化、 经济省时、 可批量操 作， 具有重要的临床应用价 值。 权利要求书2页 说明书28页 序列表16页 附图21页 CN 114891883 A 2022.08.12 CN 114891883 A 1.一种检测多基因变异的引物组合， 其特征在于， 所述多基因包括EGFR、 KRAS、 BRAF、 PIK3CA、 ERBB2、 ALK、 MET、 RET、 NTRK3、 NTRK1、 NTRK2和ROS1， 其 中， 用于检测EGFR基因变异的 引物分别如SEQ  ID No.1～4、 SEQ  ID No.7～8、 SEQ  ID No.10～11、 SEQ  ID No.13～14、 SEQ   ID No.17～22、 SEQ  ID No.23～25和SEQ  ID No.27所示； 用于检测KRAS基因变异的引物如 SEQ ID No.28～36所示； 用于检测BRAF基因变异的引物如SEQ  ID No.39～40所示； 用于检 测PIK3CA基因变异的引物分别如SEQ  ID No.42～43、 SEQ  ID No.45、 SEQ  ID No.47～48、 SEQ ID No.50所示； 用于检测ERBB2基因变异的引物分别如SEQ  ID No.52和SEQ  ID No.54 所示； 用于检测ALK基因变异的引物如SEQ  ID No.56～61所示； 用于检测MET基因变异的引 物如SEQ ID No.64～65所示； 用于检测RET基因变异的引物如SEQ  ID No.68～71所示； 用于 检测NTRK3基因变异的引物如SEQ  ID No.73～76所示； 用于检测NTRK1基因变异的引物如 SEQ ID No.79～82所示； 用于检测NTRK2基因变异的引物分别如SEQ  ID No.83和SEQ  ID  No.85所示； 用于检测ROS1基因变异的引物分别如SEQ  ID No.86～87、 SEQ  ID No.89、 SEQ   ID No.91～94所示。 2.用于靶向权利要求1所述引物组合扩增产物的探针组合， 其特征在于， 靶向用于检测 EGFR基因变异的引物的扩增产物的探针分别如SEQ  ID No.5、 SEQ  ID No.9、 SEQ  ID No.12、 SEQ ID No.15和SEQ  ID No.26所示； 靶向用于检测KRAS基因变异的引物的扩增产物的探针 如SEQ ID No.37所示； 靶向用于检测PIK3CA基因变异的引物的扩增产物的探针分别如SEQ   ID No.44和SEQ  ID No.49所示； 靶向用于检测ERBB2基因变异的引物的扩增产物的探针如 SEQ ID No.53所示； 靶向用于检测 ALK基因变异的引物的扩增产物的探针如SEQ  ID No.62 所示的探针； 靶向用于检测MET基因变异的引物的扩增产物的探针如SEQ  ID No.63所示； 靶 向用于检测RET基因变异的引物的扩增产物的探针如SEQ  ID No.67所示； 靶向用于检测基 因NTRK3变异的引物的扩增产物的探针分别如SEQ  ID No.72和SEQ  ID No.77所示； 靶向用 于检测NTRK1基因变异的引物的扩增产物的探针分别如SEQ  ID No.78所示； 靶向用于检测 NTRK2基因变异的引物的扩增产物的探针分别如SEQ  ID No.84所示； 靶向用于检测ROS1基 因变异的引物的扩增产物的探针分别如SEQ  ID No.88和SEQ ID No.90所示。 3.一种联合检测多基因变异的试剂 盒， 其特征在于， 包括权利要求1所述的引物组合和 权利要求2所述的探针组合。 4.根据权利要求3所述的试剂 盒， 其特征在于， 还包括阻滞所述多基因中的至少一种的 野生型基因扩增的Bl ocker引物组合。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 用于阻滞野生型EGFR基因扩增的 Blocker引物分别如SEQ  ID No.6和SEQ  ID No.16所示； 用于阻滞野生型KRAS基因扩增的 Blocker引物分别如SEQ  ID No.38所示； 用于阻滞野生型PIK3CA基因扩增的Blocker引物分 别如SEQ ID No.46和SEQ  ID No.51所示； 用于阻滞 野生型ERBB 2基因扩增的Blocker引物如 SEQ ID No.55所示； 用于阻滞野生型M ET基因扩增的Bl ocker引物如SEQ  ID No.66所示。 6.根据权利要求3～5任一所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括用于检测内参基因ACTB 的引物和探针， 用于检测内参基因ACTB的引物分别如SEQ  ID No.95、 SEQ  ID No.97～98所 示， 相应的探针如SEQ  ID No.96所示。 7.根据权利 要求3～4任一所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括DNA聚合酶和/或PCR扩增 缓冲液。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114891883 A 28.权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针在制备用于诊断或预测肺癌的试剂 盒中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述试剂 盒阻滞所述多基因中的至少一种 的野生型基因扩增的Bl ocker引物组合。 10.根据权利要求8 或9所述的应用， 其特征在于， 所述试剂 盒基于以下步骤诊断或预测 肺癌： S1， 获得待测生物样本的DNA和RNA样本； S2， 利用所述试剂盒对待测生物样本的DNA和RNA样本进行检测， 获得探针的荧 光信号； S3， 根据探针荧 光信号判断所述待测生物样本是否存在相应的基因变异。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114891883 A 3