(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221017015 5.4 (22)申请日 2022.02.24 (71)申请人 杭州时轮医药 科技有限公司 地址 311231 浙江省杭州市萧 山科技城传 化科创大厦1幢3楼3 06室 (72)发明人 史金阳　李旦　万建峰　郑炜　 (74)专利代理 机构 杭州华知专利事务所(普通 合伙) 33235 专利代理师 束晓前 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于器官移植前后多重病毒快速筛查 和定量检测的引物、 探 针和试剂盒 (57)摘要 本发明公开一种用于器官移植前后多重病 毒快速筛查和定量检测的引物、 探针和试剂盒及 方法， 其中， 引物、 探针包 括六对， 即通过对HCMV、 EBV、 HHV6、 HHV8、 BKV、 JCV的核酸序列进行比对分 析， 根据引物探针设计的基本原则， 分别选择无 二级结构 且高度保守的区段， 利用引物分析软件 和人工判断， 并经多次实验优化后确定适合实时 荧光定量Real  Time‑PCR(RT‑PCR或qPCR)的多对 引物和探针， 本发明还公开了对应的快速筛查和 定量检测的试剂盒及方法。 本发 明为器官移植供 体潜伏病毒感染快速筛查提供高灵敏、 高通量、 实时可靠、 准确定量的早期诊断证据， 有效减少 漏检、 假阴性或假阳性结果， 提高患者的生存质 量和术后生存率。 权利要求书3页 说明书7页 附图1页 CN 114703320 A 2022.07.05 CN 114703320 A 1.一种用于器官移植前后多重病 毒快速筛查和定量检测的引物、 探针； 其特征在于， 所 述引物、 探针包括六对， 即通过对HCMV、 EB V、 HHV6、 HHV8、 BKV、 JCV的核酸序列进行比对分析， 根据引物探针设计的基本原则， 分别选择无二级结构且高度保守的区段， 利用引物分析软 件和人工判断， 并经多次实验优化后确定适合实时荧光定量Real  Time‑PCR(RT‑PCR或 qPCR)的多对引物和探针。 2.根据权利要求1所述的用于器官移植前后多重病毒快速筛查和定量检测的引物、 探 针， 其特征在于， 所述HCMV正向、 反向引物和荧 光探针序列分别是： 正向引物5' ‑GCTTTACGGTGTTGTGTC‑3' 反向引物5' ‑TGCATAAAGAGCTTGCC‑3' 寡核苷酸探针： 5' ‑FAM‑ATGAAGGGTTGCGG‑MGB NFQ‑3' 所述EBV正向、 反向引物和荧 光探针序列分别是： 正向引物： 5' ‑AATCTTCTTCATAGCCTGAGACG ‑3' 反向引物： 5' ‑AACTACCCGCAATGAAATGGAA‑3' 寡核苷酸探针： 5' ‑Fam‑AAGGTTCGGAAATCTGT‑BHQ‑3' 所述HHV6正向、 反向引物和荧 光探针序列分别是： 正向引物： 5' ‑TCGATCATC CTCAACCTAGC‑3' 反向引物： 5' ‑CGCTCCTGGATAATTTGGCTTTG‑3' 寡核苷酸探针： 5' ‑Fam‑ATTCCTTCGGGTGTGACGTCTG GTG‑BHQ‑3' 所述HHV8正向、 反向引物和荧 光探针序列分别是： 正向引物： 5' ‑TGGGGCACGCTAT TCTG‑3' 反向引物： 5' ‑GAACACGATGTCA AATCCGTTG‑3' 寡核苷酸探针： 5' ‑Fam‑GGCACGACCATGG‑MGB NFQ‑3' 所述BKV正向、 反向引物和荧 光探针序列分别是： 正向引物： 5' ‑TGTTGAGTGTTGAGAATCTGCTGT T‑3' 反向引物： 5' ‑TGATCTACAC CAGTTTCTTAGTCAAGCT‑3' 寡核苷酸探针： BK/JC  Probe 所述JCV正向、 反向引物和荧 光探针序列分别是： 正向引物： 5' ‑AGAGTGTTGGGATCCTGTGTTTTC‑3' 反向引物： 5' ‑GCATTCCTCAGTCA AGCTGTGT ‑3' 寡核苷酸探针： BK/JC  Probe 上述六对荧 光探针分别在5'端标记有荧 光报告基团， 3'端标记有荧 光淬灭基团。 3.根据权利要求2所述的用于器官移植前后多重病毒快速筛查和定量检测的引物、 探 针， 其特征在于所述BK/JC  Probe为： 5'‑Fam‑AAAGGTAGAAGACCCTAAAG‑MGB NFQ‑3'。 4.根据权利要求2所述的用于器官移植前后多重病毒快速筛查和定量检测的引物、 探 针， 其特征在于， 所述荧光报告基团为FAM； 所述荧光淬灭基团为BHQ， 也可以根据特殊的荧 光报告基团选择相对应的荧光淬灭基团进行不同方式的多种组合以适应众多厂家多通道 荧光PCR仪器 的不同需求， 如荧光报告基团可以选择FAM、 VIC、 CY3、 ROX、 CY5、 TET、 HEX、 JOE权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114703320 A 2等； 淬灭基团选择与荧 光基团相对应的淬灭基团如 BHQ系列、 TAMRA、 DABC YL等。 5.一种用于器官移植前后多重病毒快速筛查和定量检测的试剂盒， 其特征在于， 试剂 盒包括HCMV、 EBV、 HHV6、 HHV8、 B KV、 JCV反应混合液、 DNA人工内标(BIOLINE  BIO‑35029)、 阳 性质控品、 阴性质控品； 其中所述RT ‑PCR反应液含有内标探针和如权利要求1至4任一所述 的荧光RT‑PCR引物和荧 光探针。 6.根据权利要求5所述的一种用于器官移植前后多重病毒快速筛查和定量检测的试剂 盒， 其特征在于， HCMV反应混合液由与HCMV靶多核苷酸的结合的正 向引物， 反向引物， 和能 够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团的寡核苷 酸探针组成， 另外还有实时定量PCR反应需要的PCR混合液及人工内标扩增反应混合液， 特 异探针报告基团为Cy5； EBV、 HHV6、 HHV8、 BKV、 JCV反应混合液分别由与EBV、 HHV6和HHV8、 BKV、 JCV靶多核苷酸结合的正向引物， 反向引物， 和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别 结合有荧光报告基团(均为FAM)和荧光淬灭基团的寡核苷 酸探针组成， 另外还有PCR反应需 要的混合液。 7.根据权利要求5所述的一种用于器官移植前后多重病毒快速筛查和定量检测的试剂 盒， 其特征在于， 其中阴性质控品为去离子水， 阳性质控品为含有病毒特异序列的合成DNA 各病毒株的DNA提取物。 8.一种用于器官移植前后多重病毒快速筛查和定量检测的方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： 1)DNA提取： 使用MagNA  Pure LC和罗氏MagNA核酸提取纯化试剂盒(Roche  Cat No  05323738001)， 或者其他公司生产(如Qiagen核酸提取试剂)， 或个人常用的核酸提取纯化 试剂盒， 在其推荐的操作程序下， 提取高纯度的全核酸， DNA内部参照(人工内标IEC： BIOLINE BIO‑35029)提取前加入 标本中作为质量监控， 也适用其他常用或个人不同喜好的 内参照， 如RNasn  P、 GAPDH、 B2M、 18sRNA、 TBP、 β ‑actin、 HPRT等； 2)实时定量 ‑PCR反应： 按表1配方做反应混合液： 表1.反应混合液配方 按以下方式安排96孔扩增板： 表2.96孔扩增板权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114703320 A 3