(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210171296.8 (22)申请日 2022.02.24 (71)申请人 福建农林大 学 地址 350002 福建省福州市仓山区上 下店 路15号 (72)发明人 刘新锐　邓优锦　陈炳智　吴小平　 (74)专利代理 机构 福州元创专利商标代理有限 公司 35100 专利代理师 林文弘　蔡学俊 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/92(2006.01) (54)发明名称 一种秀珍菇RNA病毒检测引物组及检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种秀珍菇RNA病毒检测引物 组及检测方法， 属于生物技术领域。 所述检测引 物组选自引物组Plp_v ir1或引物组Plp_v ir2， 引 物组Plp_vir1序列如SEQ  ID NO.1~2所示， 引物 组Plp_vir2序列如SEQ  ID NO.3~4所示。 所述检 测方法为提取待测秀珍菇样品的总RNA， 反转录 成cDNA， 然后以反转录的cDNA为模板， 以引物组 Plp_vir1或引物组Plp_vir2进行RT ‑PCR扩增， 凝 胶电泳检测扩增产物， 并对电泳结果进行判断， 确定待测秀珍菇样品是否携带RNA病毒。 本发明 结果判定简单， 操作便捷， 成本低， 具广泛应用前 景。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 114438264 A 2022.05.06 CN 114438264 A 1.一种秀珍菇RNA病毒的检测引物组， 其特征在于： 所述检测引物组选自以下引物组 Plp_vir1或引物组Plp_vir 2： 引物组Plp_vir1： 正向引物序列： 5' ‑TTTCCGATCAGGCCAATGAG‑3'， 反向引物序列： 5' ‑CCGCAGTTCCAGCCAAATAG‑3'； 引物组Plp_vir 2： 正向引物序列： 5 ’ ‑CCAACGCTTTGTCCGCATTC‑3’， 反向引物序列： 5 ’ ‑ATGACGCCATATCCAAGTCC‑3’。 2.一种秀珍菇 RNA病毒的检测方法， 其特征在于： 首先提取待测秀珍菇样品的总RNA， 通 过反转录成cDNA， 然后以反转录的cDNA 为模板， 以权利要求1所述的检测引物组作为引物进 行RT‑PCR扩增， 凝胶电泳检测扩增产物， 并对电泳结果进 行判断， 确定待测秀珍菇样品是否 携带RNA病毒。 3.根据权利要求2所述的秀珍菇RNA病毒的检测方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： （1） 提取待测秀珍菇样品的总RNA； （2） 将步骤 （1） 提取的秀珍菇总RNA反转录成cDNA； （3） 以步骤 （2） 所 得cDNA为模板， 建立 秀珍菇RNA病毒的RT ‑PCR检测； PCR扩增体系总体积25 μl： cDNA模板 1.5～3 μl， Premix  Taq 12.5 μl ， 10 μmol/L正向引 物1 μl， 10 μmol/L反向引物1 μl， d dH2O 7.5～9 μl； PCR扩增反应程序： 94℃预变性5min； 98℃变性10sec， 56℃退火30sec， 72  ℃延伸 45sec, 30～35个循环； 72 ℃延伸10mi n； 根据凝胶电泳检测的DNA图谱， 若用引物组Plp_vir1扩增 出563 bp的特异DNA条带， 或 用引物组Plp_vir2扩增出521  bp的特异DNA条带， 则表示待测秀珍菇样品携带RNA病毒， 若 采用引物组Plp_vir1和引物组Plp_vir2均未扩增出特异DNA条带， 则表示待测秀珍菇样品 不携带RNA病毒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438264 A 2一种秀珍菇RNA病毒检测引物组及检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种秀珍菇RNA病毒检测方法， 具体涉及一种秀珍菇RNA病毒的检测引 物组及检测方法， 属于生物技 术领域。 背景技术 [0002]秀珍菇Pleurotus  pulmonarius 是20世纪90年代由中国台湾等地发现将凤尾菇的 采收时间适当提前， 其风味异常鲜美， 并经过品种选育和栽培工艺的改进而开 发的新品种， 1998年林俊仁先生从 中国台湾引进， 在福建省罗源县试种成功后， 逐渐向全国推广。 秀珍菇 是高温型 的菌类， 并且其子实体朵形优美， 口感俱佳， 不仅营养价值高， 还有较高的药用价 值， 深受人们的喜爱， 在全国有很好的种植基础， 特别是近年来其菇价一直较高， 多地已掀 起了种植 秀珍菇的热潮。 [0003]然而高温季节出菇也容易受到病虫害等的侵染， 给生产带来严重 的威胁。 其中病 毒的入侵将给秀珍菇 生产带来无法预测的影响： 由于形态微小， 肉 眼看不到， 同时其可以潜 伏在菌丝中， 只有在子实体出现畸形后才被发现， 此时对产量和质量已造成不可挽 回的损 失。 此外， 病毒还 可以通过垂 直传播给下一代， 影响菌种质量。 感染病毒的秀珍菇， 将使幼小 子实体发黄， 并产生畸形 （图1） ， 严重的使子实体发黄、 萎蔫而绝收 （图2） 。 因此， 如何在早期 鉴别菌丝体是否感染了病毒至关重要。 发明内容 [0004]本发明的目的在于提供一种秀珍菇RNA病毒的检测引物组和检测方法。 通过设计 秀珍菇RNA病毒基因的特异引物， 建立秀珍菇RNA病毒的分子检测方法， 为方便、 快速、 有效 地检测秀珍菇菌种及子实体是否携带病毒提供技 术支撑。 [0005]为实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： 本发明首先提供了一种秀珍菇RNA病毒的检测引物组， 所述检测引物组选自以下 引物Plp_vir1或引物Plp_vir1： 引物组Plp_vir1： 正向引物序列： 5' ‑TTTCCGATCAGGCCAATGAG‑3'， 反向引物序列： 5' ‑CCGCAGTTCCAGCCAAATAG‑3'； 引物组Plp_vir 2： 正向引物序列： 5 ’ ‑CCAACGCTTTGTCCGCATTC‑3’， 反向引物序列： 5 ’ ‑ATGACGCCATATCCAAGTCC‑3’。 [0006]其次， 本发明还提供了一种秀珍菇RNA病毒的检测方法， 首先提取待测秀珍菇样品 的总RNA， 通过反转录成cDNA， 以反转录的cDNA为模板， 再以上述的检测引物组作为引物进 行RT‑PCR扩增， 凝胶电泳检测扩增产物， 并对电泳结果进 行判断， 确定待测秀珍菇样品是否 携带RNA病毒。 [0007]进一步的， 上述 一种秀珍菇RNA病毒的检测方法具体包括以下步骤：说　明　书 1/5 页 3 CN 114438264 A 3