(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210172437.8 (22)申请日 2022.02.24 (71)申请人 江苏沿海地区农业科 学研究所 地址 224002 江苏省盐城市开 放大道北路 九号 (72)发明人 万林生　孙红芹　倪正斌　韩配配　 陈志爱　孙明法　严国红　朱国永　 王爱民　唐红生　刘凯　施伟　 孙一标　张桂云　代金英　朱静雯　 赵绍路　胡蕾　程新杰　张梦龙　 岳红亮　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 崔自京(51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的引物组合 及其应用 (57)摘要 本发明公开了鉴定油菜和萝卜杂交种真实 性的引物组合及其应用。 属于农业分子生物学技 术领域。 本发明通过在大量的SSR引物中筛选出 Primer17、 Primer51、 Primer125、 Primer128和 Primer140构成用于鉴定油菜和萝卜杂交种真实 性的引物组合， 利用亲本和杂交种的基因组DNA 进行PCR扩增， 通过凝胶电泳处理获得电泳图谱， 通过观察杂交种是否同时具有其亲本的特征谱 带即可判定待测杂交种的真实性， 该方法方便、 快捷， 操作步骤简单， 能够对大量的待测杂交种 进行快速鉴定， 测定结果 准确。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图9页 CN 114438251 A 2022.05.06 CN 114438251 A 1.鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的引物 组合， 其特征在于， 所述引物组合为Primer17、 Primer51、 Primer125、 Primer128和Primer140引物中的至少一种： Primer17 ‑F： 5’ ‑CCAATCCGACGATACAG GTT‑3’； SEQ ID NO.1； Primer17 ‑R： 5’ ‑TTAGGGGGAGTTTCTTGCCT‑3’； SEQ ID NO.2； 或 Primer51 ‑F： 5’ ‑TCCAAAAGGTCTCGTCTCTCA ‑3’； SEQ ID NO.3； Primer51 ‑R： 5’ ‑CACATTGGTTTGTTGGTTGC‑3’； SEQ ID NO.4； 或 Primer125 ‑F： 5’ ‑CTTGTTTCCACCCTTTTCCA‑3’； SEQ ID NO.5； Primer125 ‑R： 5’ ‑TTTCAACCACCATTAACAACCA‑3’； SEQ ID NO.6； 或 Primer128 ‑F： 5’ ‑TTAGGGCTTTGGTCTTTGGA‑3’； SEQ ID NO.7； Primer128 ‑R： 5’ ‑CACATCATG GCTTTCTCCAC‑3’； SEQ ID NO.8； 或 Primer140 ‑F： 5’ ‑CGCAAATTTTTGCAATAGAGC‑3’； SEQ ID NO.9； Primer140 ‑R： 5’ ‑TTTTTAGATTTGGGATAATTCTTACT‑3’； SEQ ID NO.10。 2.鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的试剂或试剂盒， 其特征在于： 所述试剂或试剂盒含 有权利要求1所述的引物组合。 3.权利要求1所述的引物组合在鉴定油菜和萝卜杂交种真实性中的应用。 4.一种鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)油菜、 萝卜及待测品种基因 组DNA的提取； (2)分别以步骤(1)提取的基因组DNA为模板， 用权利要求1所述引物组合进行PCR扩增， 得到扩增产物； (3)将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳处 理， 得到电泳图谱； (4)对比待测品种以及其亲本的电泳图谱， 若待测品种同时具有其亲本的特征谱带， 则 判定所述待测品种为真实； 反 之， 为假。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114438251 A 2鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的引物组合及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及农业分子生物学技术领域， 更具体的说是涉及鉴定油菜和萝卜杂交种 真实性的引物组合及其应用。 背景技术 [0002]远缘杂交是创造作物新品种的重要途经， 也是改良物种的有力工具。 利用远缘杂 交技术， 可打破种、 属间的隔离， 拓宽遗传基础并为育种计划创造新的种质， 从而有效地进 行种间、 属间目标遗传物质的转移。 远缘杂交在油菜育种上已得到广泛应用， 并取得显著成 效。 目前， 国内外在甘蓝型油菜与萝卜远缘杂交及杂种鉴定方面的研究虽有报道， 却为数不 多。 甘蓝型油菜与萝卜的杂交属于芸墓属与萝卜属之间的远缘杂交。 甘蓝型油菜(B.nap us) 是经过白菜与甘蓝种间杂交， 加倍形成 的异源双二倍体。 萝卜(Raphanus  sativus)是十字 花科一种非常重要的疏菜。 萝卜中存在着许多有利的性状， 例如优良的抗逆和抗虫性。 植物 遗传育种中， 远缘杂交可以将萝卜中的优良基因转移到甘蓝型油菜中， 从而拓宽甘蓝型油 菜的遗传基础， 改良甘蓝型油菜。 [0003]随着分子生物学技术的发展， 分子标记技术越来越多的应用于农作物种子的真实 性与品种纯度鉴定。 分子标记鉴定技术是以DNA分子多态性为基础的一种遗传标记， 能稳定 遗传， 可以反映生物的个体和 群体特征。 分子标记可以直接反映DNA水平上的差异， 具有高 度的专一性和特异性， 其中SS R(simple  sequence  repeats)标记技术具有数量丰富、 多态 性高、 共显性遗传、 扩增 稳定、 易于检测等方面的优点。 SSR标记通常具有共显性 的特点， F1 杂交种具有双亲等位基因的互补带型。 SSR标记已成为现阶段用于鉴定种子纯度的常用方 法， 但是目前在油菜和萝卜杂交种使用S SR分子标记技 术鉴定其真实性的报道鲜有。 [0004]本发明通过人工杂交获得甘蓝型油菜与萝卜的远缘杂种， 并对杂种进行了分子标 记鉴定， 旨在拓宽甘蓝型油菜的遗传基础， 为相关性状的转移和创造新的生物材料提供理 论依据。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本发明提供了鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的引物组合及其应用。 [0006]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0007]本发明通过对甘蓝型油菜、 萝卜及两者的杂交F1代种子进行萌发和实验培养， 收 集叶片提取基因组DNA。 对亲本基因组DNA进行高通量测序， 组装基因组信息并搜索全基因 组中的SSR位点， 并设计合成这些特异性位点相对应的引物， 利用亲本和杂交种的基因组 DNA进行PCR扩增， 确 定引物的特异性、 有效性， 挑选出最合适的5对引物用于杂交种的真实 性鉴定。 [0008]鉴定油菜和萝卜杂交种真实性的引物组合， 引物组合为Primer17、 Primer51、 Primer125、 Primer128和Primer140引物中的至少一种： [0009]Primer17 ‑F： 5’ ‑CCAATCCGACGATACAG GTT‑3’； SEQ ID NO.1；说　明　书 1/6 页 3 CN 114438251 A 3