(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210174823.0 (22)申请日 2022.02.24 (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风 华路 818号 (72)发明人 蔡振东　蓝航镇　郭影琪　潘道东　 曾小群　吴振　周松　 (74)专利代理 机构 宁波奥圣专利代理有限公司 33226 专利代理师 何仲 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测 用引物组和方法 (57)摘要 本发明公开了用于同时鉴别12种肉源食品 的多重PCR检测用引物组和方法， 特点是包括马 特异性引物对、 鸽子特异性引物对、 骆驼特异性 引物对、 兔特异性引物对、 鸵鸟特异性引物对、 牛 特异性引物对、 火鸡特异性引物对、 狗特异性引 物对、 鸡特异性引物对、 鸭特异性引物对、 猫 特异 性引物对和鹅特异性引物对， 包括以下步骤1） 样 品DNA提取； 2） 根据马、 鸽子、 兔子、 骆驼、 鸵鸟、 牛、 猫、 火鸡、 狗、 鸡、 鸭和鹅基因序列分别设计物 种特异性引物； 3） 多重PCR反应 条件的建立； 4） 进 行琼脂糖凝胶电泳检测判断是否掺杂以及掺杂 的肉类， 优点是操作简单、 灵敏度高和特异性 好。 权利要求书3页 说明书10页 序列表4页 附图5页 CN 114561476 A 2022.05.31 CN 114561476 A 1.一种用于同时鉴别12种肉源食品的多重PCR检测用引物组， 其特征在于包括马特异 性引物对、 鸽子特异 性引物对、 骆驼特异 性引物对、 兔特异 性引物对、 鸵鸟特异 性引物对、 牛 特异性引物对、 火鸡特异 性引物对、 狗特异 性引物对、 鸡特异 性引物对、 鸭特异 性引物对、 猫 特异性引物对和鹅 特异性引物对， 所述的马特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  CCCCGCTTCCTCCCTCTGA  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  TAGGTATGGTTATTTCCGGGACG  ‑  3’； 鸽子特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  GGCCCAGAAAGCATCAC CTC  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  ATTGGTATAGCGAT TAGGGACAG  ‑  3’； 骆驼特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  CTAGCCCAGAAAATACCACAT  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  CATAGACGAGT TCGCTCCGTA  ‑  3’； 兔特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  AATCCGCTTCTACCCCTTG  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  TATACCTGTGAGGGCCAGACT  ‑  3’； 鸵鸟特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  AGCGCCCTCTAGCTCATC C  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  GCTGCTTTAGGGCCAACGTG  ‑  3’； 牛特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  ATGAGCCCACCATATATTCACT  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  TGTCGTGGTTAAGTCTACAGTCA   ‑  3’； 火鸡特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  AGTTGACCACCGTATAGTAGTC C  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  TCGTCCTGGGATTGCATCTGTCT   ‑  3’； 狗特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  CCCTTGCTCGTA ATGTCCCT  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  CGAGATGTC CCATTTGCGAGA  ‑  3’； 鸡特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  CAGGTATCAGGCACACTCAGC   ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  CACTCTTTACGCCGGGTAGC  ‑  3’； 鸭特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  CCACGCGAATAAAGCATAGC C  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  TTTCGTTTGTAGCCCTGGTG  ‑  3’； 猫特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  TCTTAGCAGCG GGAATCACT  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  AAGAGTAGC CAGTCAACTAAACA  ‑  3’； 鹅特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  TCGCCTTCTCCTCAGTAGCTC   ‑  3’，权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114561476 A 2反向引物： 5 ’ ‑  TGTCGCAGTCTGATACGAT T  ‑  3’。 2.一种用于同时鉴别12种肉源 食品的多重PCR检测方法， 其特 征在于包括以下步骤： （1） 样品DNA提取 根据基因 组DNA提取 试剂盒使用说明， 进行基因 组DNA提取， 并测DNA浓度； （2） 多重PCR引物设计 根据马NADH脱氢酶亚基5、 鸽子NADH脱氢酶亚基5、 兔子NADH脱氢酶亚基5、 骆驼16S   rRNA、 鸵鸟16S  rRNA、 牛细胞色素c氧化酶亚基I、 火鸡细胞色素c氧化酶亚基 Ⅱ、 狗D‑loop、 鸡12S rRNA、 鸭NADH脱氢酶亚基6、 猫细胞色素c氧化酶亚基I和鹅细胞色素b基因序列 分别 设计物种特异性引物； 其中 所述的马特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  CCCCGCTTCCTCCCTCTGA  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  TAGGTATGGTTATTTCCGGGACG  ‑  3’； 鸽子特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  GGCCCAGAAAGCATCAC CTC  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  ATTGGTATAGCGAT TAGGGACAG  ‑  3’； 骆驼特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  CTAGCCCAGAAAATACCACAT  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  CATAGACGAGT TCGCTCCGTA  ‑  3’； 兔特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  AATCCGCTTCTACCCCTTG  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  TATACCTGTGAGGGCCAGACT  ‑  3’； 鸵鸟特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  AGCGCCCTCTAGCTCATC C  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  GCTGCTTTAGGGCCAACGTG  ‑  3’； 牛特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  ATGAGCCCACCATATATTCACT  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  TGTCGTGGTTAAGTCTACAGTCA   ‑  3’； 火鸡特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  AGTTGACCACCGTATAGTAGTC C  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  TCGTCCTGGGATTGCATCTGTCT   ‑  3’； 狗特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  CCCTTGCTCGTA ATGTCCCT  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  CGAGATGTC CCATTTGCGAGA  ‑  3’； 鸡特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  CAGGTATCAGGCACACTCAGC   ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  CACTCTTTACGCCGGGTAGC  ‑  3’； 鸭特异性引物对的序列为： 正向引物： 5 ’ ‑  CCACGCGAATAAAGCATAGC C  ‑  3’， 反向引物： 5 ’ ‑  TTTCGTTTGTAGCCCTGGTG  ‑  3’；权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114561476 A 3