(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210179475.6 (22)申请日 2022.02.25 (71)申请人 复旦大学 地址 200433 上海市杨 浦区邯郸路2 20号 (72)发明人 周素娟　梁欣悦　张志一　 (74)专利代理 机构 上海科盛知识产权代理有限 公司 312 25 专利代理师 褚明伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于微孔恒温扩增反应检测呼吸道RNA病毒 核酸的引物组、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明涉及基于微孔恒温扩增反应检测呼 吸道RNA病毒核 酸的引物组、 试剂盒及其应用， 其 中包括包埋在不同微孔里的特异性引物组、 包含 Bst酶和逆转录酶的反应混合液。 可以同时检测 SARS‑CoV‑1、 SARS‑CoV‑2(包括SARS ‑CoV‑2‑N和 SARS‑CoV‑2‑E)、 甲型流感病毒(Inf  A)、 乙型流 感病毒(Influenza  B virus， IBV)、 呼吸道合胞 病毒A(Respiratory  syncytial  virus A， RSV  A)和呼吸道合胞病毒B(Respiratory  syncytial   virus B， RSV B)这6种呼吸道RNA病毒核 酸。 与现 有技术相比， 本发明使用改进的一种每种靶 标仅 需要4条引物进行恒温扩增的技术， 与微孔反应 技术相结合， 对6种呼吸道RNA病毒核酸进行高通 量检测， 每组引物靶标单独为一孔， 引物之间没 有交叉反应， 本发明在微孔中进行反应， 对样品 量和试剂量要求低， 经济成本也降低， 并且能一 次进行多 靶标的高通 量样本筛查。 权利要求书3页 说明书20页 序列表8页 附图8页 CN 115261509 A 2022.11.01 CN 115261509 A 1.用于检测呼吸道RNA病毒核酸的引物组， 其特征在于， 选自用于检测SARS ‑CoV‑1、 SARS‑CoV‑2的N基因、 SARS ‑CoV‑2的E基因、 甲型流感病毒、 乙型流感病毒、 呼吸道合胞病毒A 或呼吸道合胞病毒B的引物组中的一组或几组； 其中， 用于检测SARS ‑CoV‑1的引物组包括检测引物Ft ‑s1和Bt‑s1， Ft‑s1的核苷酸序列 如SEQ ID NO.1所示， Bt ‑s1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 用于检测SARS ‑CoV‑2的N基因的引物组包括检测引物Ft ‑n和Bt‑n， Ft‑n的核苷酸序列 如SEQ ID NO.5所示， Bt ‑n的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示； 用于检测SARS ‑CoV‑2的E基因的引物组包括检测引物Ft ‑e和Bt‑e， Ft‑e的核苷酸序列 如SEQ ID NO.9所示， Bt ‑e的核苷酸序列如SEQ  ID NO.10所示； 用于检测甲型流感病毒的引物组包括检测引 物Ft‑ia和Bt‑ia， Ft‑ia的核苷酸序列如 SEQ ID NO.13所示， Bt ‑ia的核苷酸序列如SEQ  ID NO.14所示； 用于检测乙型流感病毒的引物组包括检测引 物Ft‑ib和Bt‑ib， Ft‑ib的核苷酸序列如 SEQ ID NO.17所示， Bt‑ib的核苷酸序列如SEQ  ID NO.18所示； 用于检测呼吸道合胞病毒A的引物组包括检测引物Ft ‑rsva和Bt ‑rsva， Ft‑rsva的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.21所示， Bt ‑rsva的核苷酸序列如SEQ  ID NO.22所示； 用于检测呼吸道合胞病毒B的引物组包括检测引物Ft ‑rsvb和Bt ‑rsvb， Ft‑rsvb的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.25所示， Bt ‑rsvb的核苷酸序列如SEQ  ID NO.26所示。 2.根据权利要求1所述用于检测呼吸道RNA病毒核酸的引物组， 其特征在于， 用于检测 呼吸道RNA病 毒核酸的引物组， 除了包括用于检测SARS ‑CoV‑1、 SARS‑CoV‑2的N基因、 SARS ‑ CoV‑2的E基因、 甲型流 感病毒、 乙型流 感病毒、 呼吸道 合胞病毒A或呼吸道 合胞病毒B的引物 组中的一组或几组作为基本检测引物以外， 还 包括加速引物； 用于检测SARS ‑CoV‑1的引物组还包括加速引物为IF ‑s1和IB‑s1， IF‑s1的核苷酸序列 如SEQ ID NO.3所示， IB ‑s1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 用于检测SARS ‑CoV‑2的N基因的引物组还包括加速引物为IF ‑n和IB‑n， IF‑n的核苷酸 序列如SEQ  ID NO.7所示， IB‑n的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示； 用于检测SARS ‑CoV‑2的E基因的引物组还包括加速引物为IF ‑e和IB‑e， IF‑e的核苷酸 序列如SEQ  ID NO.11所示， IB ‑e的核苷酸序列如SEQ  ID NO.12所示； 用于检测甲型流感病毒的引物组还包括加速引物为IF ‑ia和IB‑ia， IF‑ia的核苷酸序 列如SEQ ID NO.15所示， IB ‑ia的核苷酸序列如SEQ  ID NO.16所示； 用于检测乙型流感病毒的引物组还包括加速引物为IF ‑ib和IB‑ib， IF‑ib的核苷酸序 列如SEQ ID NO.19所示， IB ‑ib的核苷酸序列如SEQ  ID NO.20所示； 用于检测呼吸道合胞病毒A的引物组还包括加速引物为IF ‑rsva和IB ‑rsva， IF‑rsva的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.23所示， IB ‑rsva的核苷酸序列如SEQ  ID NO.24所示； 用于检测呼吸道合胞病毒B的引物组还包括加速引物为IF ‑rsvb和IB ‑rsvb， IF‑rsvb的 核苷酸序列如SEQ  ID NO.27所示， IB‑rsvb的核苷酸序列如SEQ  ID NO.28所示。 3.用于检测呼吸道RNA病毒核酸的试剂盒， 其特征在于， 包括用于检测SARS ‑CoV‑1、 SARS‑CoV‑2的N基因、 SARS ‑CoV‑2的E基因、 甲型流感病毒、 乙型流感病毒、 呼吸道合胞病毒A 或呼吸道合胞病毒B的引物组中的一组或几组； 其中， 用于检测SARS ‑CoV‑1的引物组包括检测引物Ft ‑s1和Bt‑s1， Ft‑s1的核苷酸序列权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115261509 A 2如SEQ ID NO.1所示， Bt ‑s1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 用于检测SARS ‑CoV‑2的N基因的引物组包括检测引物Ft ‑n和Bt‑n， Ft‑n的核苷酸序列 如SEQ ID NO.5所示， Bt ‑n的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示； 用于检测SARS ‑CoV‑2的E基因的引物组包括检测引物Ft ‑e和Bt‑e， Ft‑e的核苷酸序列 如SEQ ID NO.9所示， Bt ‑e的核苷酸序列如SEQ  ID NO.10所示； 用于检测甲型流感病毒的引物组包括检测引 物Ft‑ia和Bt‑ia， Ft‑ia的核苷酸序列如 SEQ ID NO.13所示， Bt ‑ia的核苷酸序列如SEQ  ID NO.14所示； 用于检测乙型流感病毒的引物组包括检测引 物Ft‑ib和Bt‑ib， Ft‑ib的核苷酸序列如 SEQ ID NO.17所示， Bt‑ib的核苷酸序列如SEQ  ID NO.18所示； 用于检测呼吸道合胞病毒A的引物组包括检测引物Ft ‑rsva和Bt ‑rsva， Ft‑rsva的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.21所示， Bt ‑rsva的核苷酸序列如SEQ  ID NO.22所示； 用于检测呼吸道合胞病毒B的引物组包括检测引物Ft ‑rsvb和Bt ‑rsvb， Ft‑rsvb的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.25所示， Bt ‑rsvb的核苷酸序列如SEQ  ID NO.26所示。 4.根据权利要求3所述用于检测呼吸道RNA病毒核酸的试剂盒， 其特征在于， 用于检测 呼吸道RNA病 毒核酸的引物组， 除了包括用于检测SARS ‑CoV‑1、 SARS‑CoV‑2的N基因、 SARS ‑ CoV‑2的E基因、 甲型流 感病毒、 乙型流 感病毒、 呼吸道 合胞病毒A或呼吸道 合胞病毒B的引物 组中的一组或几组作为基本检测引物以外， 还 包括加速引物； 用于检测SARS ‑CoV‑1的引物组还包括加速引物为IF ‑s1和IB‑s1， IF‑s1的核苷酸序列 如SEQ ID NO.3所示， IB ‑s1的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 用于检测SARS ‑CoV‑2的N基因的引物组还包括加速引物为IF ‑n和IB‑n， IF‑n的核苷酸 序列如SEQ  ID NO.7所示， IB‑n的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示； 用于检测SARS ‑CoV‑2的E基因的引物组还包括加速引物为IF ‑e和IB‑e， IF‑e的核苷酸 序列如SEQ  ID NO.11所示， IB ‑e的核苷酸序列如SEQ  ID NO.12所示； 用于检测甲型流感病毒的引物组还包括加速引物为IF ‑ia和IB‑ia， IF‑ia的核苷酸序 列如SEQ ID NO.15所示， IB ‑ia的核苷酸序列如SEQ  ID NO