(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210176914.8 (22)申请日 2022.02.25 (71)申请人 河南中医药大学 地址 450000 河南省郑州市郑东 新区金水 东路156号 (72)发明人 杨林林　初雷霞　乔璐　苏秀红　 董诚明　 (74)专利代理 机构 北京和联顺知识产权代理有 限公司 1 1621 代理人 余王敏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测北柴胡NCED基因的引物和实 时荧光定量PCR方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测北柴胡NCED基 因的引物和实时荧光定量PCR方法， 属于荧光定 量PCR方法领域， 旨在解决针对现有 技术不足， 缺 少一种用于检测北柴胡NCED基因的引物及实时 荧光定量PCR方法， 无法对北柴胡NCED基因进行 快速、 高效、 高灵敏度的检测的问题。 通过提取北 柴胡不同组织(根、 茎、 叶、 花)的总RNA， 以北柴胡 actin基因为内参基因进行对照， 开展实时荧光 定量PCR检测， 并采用2‑Δ Δ Ct法检测分析NCED基 因在北柴胡 不同组织(根、 茎、 叶、 花)中的分布与 表达差异， 能够实现对北柴胡 不同组织的NCED基 因进行实时荧光定量PCR检测， 并具有快速、 高 效、 高灵敏度的特点， 同时对于研究北柴胡抗干 旱逆境胁迫相关机制的研究具有重要的意 义。 权利要求书2页 说明书4页 附图1页 CN 114350765 A 2022.04.15 CN 114350765 A 1.一种用于检测北柴胡NCED基因的引物和实时荧光定量PCR方法， 其特征在于： 包括以 下步骤： 步骤1， 北柴胡目的基因NC ED的实时荧 光定量引物设计： 利用如SEQ  ID NO.1所示北柴胡NC ED基因的序列， 设计引物； 步骤2， 北柴胡内参基因acti n的实时荧 光定量引物设计： 利用如SEQ  ID NO.2所示北柴胡acti n基因的序列， 设计引物； 步骤3， 北柴胡不同植物组织cDNA逆转录： 提取北柴胡不同组织(根、 茎、 叶、 花)的总RNA， 并将提取的不 同组织的总 RNA分别逆转 录成cDNA， ‑20℃保存备用； 步骤4， 北柴胡NC ED基因的实时荧 光定量PCR检测： 以逆转录的cD NA为模板， 以actin为内参基因， 在QuantStudio  5 Applied Biosystems 上对北柴胡NCED基因的表达水平进行检测， 分析NCED基因在北柴胡不同组织(根、 茎、 叶、 花)中的分布与表达 差异。 2.根据权利要求1所述的一种用于检测北柴胡NCED基因的引物和 实时荧光定量PCR方 法， 其特征在于： 所述步骤1中， 利用SEQ  ID NO.1所示北柴胡NCED基因序列， 通过Primer   Premier5软件， 设计出产物片段 大小在80～ 200bp， 退火温度5 5℃的引物序列。 3.根据权利要求1所述的一种用于检测北柴胡NCED基因的引物和 实时荧光定量PCR方 法， 其特征在于： 所述步骤2中， 利用SEQ  ID NO.2所示北柴胡actin基因序列， 通过Primer   Premier5软件， 设计出产物片段 大小在80～ 200bp， 退火温度5 5℃的引物序列。 4.根据权利要求1所述的一种用于检测北柴胡NCED基因的引物和 实时荧光定量PCR方 法， 其特征在于： 所述步骤3中， 采集北柴胡不同组织(根、 茎、 叶、 花)样本， 蒸馏水清洗干净 后用吸水纸吸去 水分， 迅速投入到液氮中进 行保存； 利用多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒对 北柴胡不同组织(根、 茎、 叶、 花)样本的总RNA分别进行提取， 取1～10微升总RNA， 利用 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录 试剂盒进行反转录生成cDNA， ‑20 ℃保存备用。 5.根据权利要求1所述的一种用于检测北柴胡NCED基因的引物和 实时荧光定量PCR方 法， 其特征在于： 所述步骤4中， 利用TaKaRa  Premix Ex TaqTM试剂盒， 以北柴胡不同组织 (根、 茎、 叶、 花)样本cDNA为模板， 开展北柴胡NCED基因的实时荧光定量PCR检测， 以北柴胡 actin基因为内参基因进行对照， 采用2‑ΔΔCt法检测北柴胡NCED基因在不同组织(根、 茎、 叶、 花)中的分布与表达情况。 6.根据权利要求1所述的一种北柴胡NCED基因的荧光定量PCR引物， 其特征在于： 所述 引物包括： 上游引物SEQ  ID NO.3： 5′ ‑GATTCTTCATCCTCCTCTGC‑3′； 下游引物SEQ  ID NO.4： 5′ ‑CGATAACATTTTCAACTGCG‑3′， 该引物是 所述检测方法步骤1所设计引物的一种但不仅有这 一种。 7.根据权利 要求1所述的一种北柴胡actin基因的荧光定量PCR引物， 其特征在于： 所述 引物包括： 上游引物SEQ  ID NO.5： 5′ ‑TGGGATGACATG GAGAAGAG‑3′； 下游引物SEQ  ID NO.6： 5′ ‑AGAAAGAACAGCCTGGATTG‑3′，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114350765 A 2该引物是 所述检测方法步骤2所设计引物的一种但不仅有这 一种。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114350765 A 3