(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210179487.9 (22)申请日 2022.02.25 (71)申请人 复旦大学 地址 200433 上海市杨 浦区邯郸路2 20号 (72)发明人 周素娟　梁欣悦　张志一　 (74)专利代理 机构 上海科盛知识产权代理有限 公司 312 25 专利代理师 褚明伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 基于微孔恒温反应检测肠道RNA病毒核酸的 引物组、 试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明涉及基于微孔恒温反应检测肠道RNA 病毒核酸的引物组、 试剂盒及其应用， 其中包括 包埋在不同微孔里的特异性引物组、 包含Bst酶 和逆转录酶的反应 混合液。 可以同时检测诺如病 毒GⅠ/GⅡ、 甲型肝炎病毒、 CA16、 EV71这4种肠道 RNA病毒核酸。 本发明使用改进的每种靶标仅需 要2‑4条引物进行的恒温扩增技术， 与微孔反应 技术相结合， 对4种肠 道RNA病毒核 酸进行高通量 检测， 每组引物靶标单独为一孔， 引物之间没有 交叉反应， 使用离心的方式使试剂和模板混合物 进入包埋有引物组靶标的微孔中。 在工艺要求 上， 相比微流控来说较为简单， 通用性很高， 检测 灵敏度可以达到10个拷贝， 降低了加样的复杂 性， 在临床检测中具有 优势。 权利要求书3页 说明书15页 序列表6页 附图6页 CN 114807433 A 2022.07.29 CN 114807433 A 1.用于检测肠道RNA病毒核酸的引物组， 其特征在于， 选自用于检测诺如病毒G Ⅰ、 诺如 病毒GⅡ、 甲型肝炎病毒、 CA16或EV71的引物组中的一组或几组； 其中， 用于检测诺如病毒G Ⅰ的引物组包括检测引 物Ft‑Ⅰ和Bt‑Ⅰ， Ft‑Ⅰ的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示， Bt ‑Ⅰ的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 用于检测诺如病毒G Ⅱ的引物组包括检测引物Ft ‑Ⅱ和Bt‑Ⅱ， Ft‑Ⅱ的核苷酸序列如 SEQ ID NO.5所示， Bt ‑Ⅱ的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示； 用于检测甲型肝炎病毒的引物组包括检测引 物Ft‑h和Bt‑h， Ft‑h的核苷酸序列如SEQ   ID NO.9所示， Bt ‑h的核苷酸序列如SEQ  ID NO.10所示； 用于检测CA16的引物组包括检测引物Ft ‑c和Bt‑c， Ft‑c的核苷酸序列如SEQ  ID NO.13 所示， Bt‑c的核苷酸序列如SEQ  ID NO.14所示； 用于检测EV71的引物组包括检测引物Ft ‑e和Bt‑e， Ft‑e的核苷酸序列如SEQ  ID NO.17 所示， Bt‑e的核苷酸序列如SEQ  ID NO.18所示。 2.根据权利要求1所述用于检测肠道RNA病毒核酸的引物组， 其特征在于， 用于检测肠 道RNA病毒核酸的引物组， 除了包括用于检测诺如病毒GΙ、 诺如病毒GΠ、 甲型肝炎病毒、 CA16或EV71的引物组中的一组或几组作为基本检测引物以外， 还 包括加速引物， 用于检测诺如病毒G Ⅰ的引物组还包括加速引物为IF ‑Ⅰ和IB‑Ⅰ， IF‑Ⅰ的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示， IB ‑Ⅰ的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 用于检测诺如病毒G Ⅱ的引物组还包括加速引物为IF ‑Ⅱ和IB‑Ⅱ， IF‑Ⅱ的核苷酸序列 如SEQ ID NO.7所示， IB‑Ⅱ的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示； 用于检测甲型肝炎病毒的引物组还包括加速引物为IF ‑h和IB‑h， IF‑h的核苷酸序列如 SEQ ID NO.11所示， IB ‑h的核苷酸序列如SEQ  ID NO.12所示； 用于检测CA16的引物组还包括加速引物为IF ‑c和IB‑c， IF‑c的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.15所示， IB ‑c的核苷酸序列如SEQ  ID NO.16所示； 用于检测EV71的引物组还包括加速引物为IF ‑e和IB‑e， IF‑e的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.19所示， IB ‑e的核苷酸序列如SEQ  ID NO.20所示。 3.用于检测肠道RNA病毒核酸的的试剂盒， 其特征在于， 包括有检测诺如病毒G Ⅰ、 诺如 病毒GⅡ、 甲型肝炎病毒、 CA16或EV71的引物组中的一组或几组； 其中， 用于检测诺如病毒GΙ 的引物组包括检测引 物Ft‑Ⅰ和Bt‑Ⅰ， Ft‑Ⅰ的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示， Bt ‑Ⅰ的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 用于检测诺如病毒G Ⅱ的引物组包括检测引物Ft ‑Ⅱ和Bt‑Ⅱ， Ft‑Ⅱ的核苷酸序列如 SEQ ID NO.5所示， Bt ‑Ⅱ的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示； 用于检测甲型肝炎病毒的引物组包括检测引 物Ft‑h和Bt‑h， Ft‑h的核苷酸序列如SEQ   ID NO.9所示， Bt ‑h的核苷酸序列如SEQ  ID NO.10所示； 用于检测CA16的引物组包括检测引物Ft ‑c和Bt‑c， Ft‑c的核苷酸序列如SEQ  ID NO.13 所示， Bt‑c的核苷酸序列如SEQ  ID NO.14所示； 用于检测EV71的引物组包括检测引物Ft ‑e和Bt‑e， Ft‑e的核苷酸序列如SEQ  ID NO.17 所示， Bt‑e的核苷酸序列如SEQ  ID NO.18所示。 4.根据权利要求3所述用于检测肠道RNA病毒核酸的的试剂盒， 其特征在于， 除了包括 有检测诺如病毒G Ⅰ、 诺如病毒G Ⅱ、 甲型肝炎病毒、 CA16或EV71的引物组中的一组或几组以权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114807433 A 2外， 还包括有检测诺如病毒G Ⅰ、 诺如病毒G Ⅱ、 甲型肝炎病毒、 CA16或EV71的加速引物； 用于检测诺如病毒GΙ的引物组还包括加速引物为IF ‑Ⅰ和IB‑Ⅰ， IF‑Ⅰ的核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示， IB ‑Ⅰ的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 用于检测诺如病毒GΠ的引物组还包括加速引物为IF ‑Ⅱ和IB‑Ⅱ， IF‑Ⅱ的核苷酸序列 如SEQ ID NO.7所示， IB‑Ⅱ的核苷酸序列如SEQ  ID NO.8所示； 用于检测甲型肝炎病毒的引物组还包括加速引物为IF ‑h和IB‑h， IF‑h的核苷酸序列如 SEQ ID NO.11所示， IB ‑h的核苷酸序列如SEQ  ID NO.12所示； 用于检测CA16的引物组还包括加速引物为IF ‑c和IB‑c， IF‑c的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.15所示， IB ‑c的核苷酸序列如SEQ  ID NO.16所示； 用于检测EV71的引物组还包括加速引物为IF ‑e和IB‑e， IF‑e的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.19所示， IB ‑e的核苷酸序列如SEQ  ID NO.20所示。 5.根据权利要求3所述用于检测肠道RNA病毒核酸的的试剂盒， 其特征在于， 用于检测 肠道RNA病毒核酸的的试剂盒括以下组分： 反应试剂混合液、 微孔板、 阳性对照、 阴性对照和 微孔板封膜； 所述微孔板的孔中分别包埋用于检测 诺如病毒G Ⅰ、 诺如病毒G Ⅱ、 甲型肝炎病 毒、 CA16或EV71的引物组。 6.根据权利要求5所述用于检测肠道RNA病毒核酸的的试剂盒， 其特征在于， 所述微孔 板里进行引物包埋： 孔1 ‑5分别包埋： 诺如病毒G Ⅰ、 诺如病毒G Ⅱ、 甲型肝炎病毒、 CA16、 EV71 的靶标引物组， 所述诺如病毒G Ⅰ的引物组靶标为SEQ  ID NO： 1‑SEQ ID NO： 4所示序列的引 物； 所述诺如病毒G Ⅱ的引物组靶标为SEQ  ID NO： 5‑SEQ ID NO： 8所示序列的引物； 所述甲 型肝炎病毒的引物组靶 标为SEQ ID NO： 9‑SEQ ID NO： 12所示序列的引物； 所述CA16的引物 组靶标为SEQ  ID NO： 13‑SEQ ID NO： 16所示序列的引物； 所述的EV71引物组靶标为SEQ  ID  NO： 17‑SEQ ID NO： 20所示序列的引物。 7.根据权利要求5所述用于检测肠道RNA病毒核酸的的试剂盒， 其特征在于， 所述反应 试剂混合液包 含有Bst DNA聚合酶、 聚合酶逆转录酶、 dNTPs、 荧 光染料、 MgSO4、 反应缓冲液。 8.根据权利要求7所述用于检测肠道RNA病毒核酸的的试剂盒， 其特征在于， 所述Bst   DNA聚合酶为浓度为8U/ μL的Bst  DNA聚合酶水 溶液； 所述逆转录酶浓度为15U/ μL； 所述10×Primer Mix包含浓度均为40 μM的检测引物Ft与Bt， 浓度均为10 μM的加速引物 IF和IB， 均使用10％海藻糖去离 子水进行稀释； 在终体系中， 检测引物Ft 或Bt的终浓度均为1.6 μM， 加速引物IF或IB的终浓度均为0.4 μ M， 所述Bst  DNA聚合酶的终浓度为0.32U/ μL， 逆转录酶的终浓度为0.6U/ μL， dNTPs的终浓度 为1.4mM， 荧 光染料终浓度为1 ×， MgSO4的终浓度为8mM， 反应缓冲液终浓度为1 ×。 9.如权利要求1或2所述用于检测肠道RNA病 毒核酸的引物 组或如权利要求3或4所述用 于检测肠