(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221018345 3.7 (22)申请日 2022.02.25 (71)申请人 山东第一医科 大学附属省立医院 （山东省立医院） 地址 250021 山东省济南市槐荫区经五纬 七路324号 (72)发明人 白晓卉　徐璐璐　王榕榕　刘静文　 (74)专利代理 机构 山东祺智知识产权代理有限 公司 373 61 专利代理师 赵斌 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种Starg ardt病突变 检测试剂盒 (57)摘要 本发明涉及生物基因技术领域， 具体涉及一 种Stargardt病突变检测试剂盒， 发明人首先发 现了ABCA4基因上c.215的G到A的新突变位点， 之 后研发了相应的试剂盒， 其包括扩增引物、 特异 性探针、 锁式探针、 滚环引物、 Taq  DNA连接酶、 Bst DNA聚合酶及反应缓冲液等； 该试剂盒首先 以人DNA片段为模板， 在Taq  DNA连接酶的作用下 使锁式探针连接成环状产物， 然后在滚环引物的 作用下进行等温滚环扩增， 通过琼脂糖凝胶电泳 检测人DNA中是否存在 ABCA4基因上c.215的G到A 的新突变位点。 本发明首先发现的新突变增加了 ABCA4基因突变谱， 同时所提供的试剂盒特异性 强、 灵敏度高， 无需温度循环， 操作简单， 为临床 上Stargardt病的检测提供了指导。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图4页 CN 114480624 A 2022.05.13 CN 114480624 A 1.一种Starg ardt病突变 检测试剂盒， 其特 征在于： 其主 要组成如下： 10μM扩增引物、 10μM锁式探针、 10μM特异性探针、 10μM滚环引物、 Taq  DNA连接酶、 Bst   DNA聚合酶及反应缓冲液； 所述的扩增引物为： 上游引物， 其核苷酸序列如Seq  ID No:5所示， 下游引物， 其核苷酸 序列如Seq  ID No:6所示； 其中所述的特异性探针包括突变型探针， 其核苷酸序列如Seq  ID No:7所示， 野生型引 物探针， 其核苷酸序列如Seq  ID No:8所示； 所述的锁式探针， 其核苷酸序列如Seq  ID No:9所示； 所述的滚环引物， 其核苷酸序列如Seq  ID No:10所示。 2.根据权利要求1所述Stargardt病突变检测试剂盒， 其特征在于： 试剂盒中还含有 40U/ μl Taq DNA连接酶； 8 U/ μl Taq Bst DNA聚合酶； 反应缓冲液包括2 ×Taq PCR预混液、 1 ×Taq DNA连接酶反应缓冲液、 1 ×Bst DNA聚合酶反应缓冲液和1mM  dNTPs。 3.一段具有c.215G＞A突变点的ABCA4基因DNA片段， 其特征在于： 其核苷酸序列如Seq   ID No:1所示， 其编码的氨基酸序列如Seq  ID No:2所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480624 A 2一种Stargardt病突变检测试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及基因技 术领域， 具体涉及一种Starg ardt病突变 检测试剂盒。 背景技术 [0002]Stargardt病(STGD1  OMIM#248200)， 也被称为Stargardt黄斑营养不良、 青少年黄 斑变性或黄斑眼底， 是遗传性视网膜疾病最常见 的原因之一， 占遗传性视网膜疾病相关失 明的12％。 Stargardt病由Karl  Stargardt 于1909年首次描述， 临床表现以青春期黄斑营养 不良伴中心视力下降和双侧黄斑区萎缩性改变为特征， 包括黄斑紫铜样改变、 牛眼黄斑病 变、 进行性黄斑萎缩和视网膜后极部的黄白色斑点； 组织学上， 该病与视网膜色素上皮中大 量脂褐素沉积所导致的感光细胞死亡和视网膜变性密切相关。 1998年， Blacharski等人估 计Stargardt病的全球流行率为1/10000， 而最近英国眼科监测局的报告 中表示， 在英国每 年的发病率估计为每10 0,000人中有0.1 10‑0.128人。 [0003]Stargardt病遗传方式主要为常染色体隐性遗传， 由AB CA4基因的双等位基因突变 引起。 ABCA4基因定位于染色体1p22.1， 由50个外显子组成， 编码 视网膜特异性膜相关ABCA4 蛋白。 ABCA4蛋白是一个2273个氨基酸的蛋白质， 分子量约为250kDa， 属于ATP结合 盒转运蛋 白超家族的成员， 定位于视杆和视锥感光细胞外节的盘膜边缘， 并在视觉周期 中的视黄醇 循环中发挥重要作用。 在结构上， ABCA4蛋白由两个不相同但同源的部分组成， 每个部分都 包含一个跨膜结构域， 一个核苷酸结合结构域和一个胞浆结构域。 ABCA4基因突变导致 ABCA4转运蛋白的功能障碍， 有毒的维A酸积累， 导致视网膜色素上皮和光 感受器的退化， 从 而导致不可逆的中心视力丧失。 [0004]ABCA4基因是Allikmets等人于1997年首次发现的， 到目前为止， 文献中已经报道 了2000多个ABCA4突变(www.lovd.nl/ABCA4)， 但仍有许多患者无法获得明确诊断， 与 Stargardt病相关 的致病位点仍需进一步研究， 任何一个新突变的发现对于疾病的诊断和 预防都有着重要作用。 [0005]因此开发一种快速、 简便、 准确、 经济的基因突变检测方法， 对Stargardt病患者 ABCA4基因突变筛查工作具有重要意 义。 发明内容 [0006]基于上述的原因， 本 发明提供了一种Stargardt病突变检测试剂盒， 该试剂盒包括 扩增引物、 特异性探针、 锁式探针、 滚环引物、 Taq  DNA连接酶、 Bst  DNA聚合酶及反应缓冲液 等； 该试剂盒首先以人DNA片段为模板， 在 TaqDNA连接酶的作用下使锁式探针连接成环状产 物， 然后在 滚环引物的作用下进 行等温滚环扩增， 通过琼脂糖凝胶电泳检测人DNA中是否存 在ABCA4基因上c.215的G到A的新突变位点。 本发明首先发现的新突变增加了ABCA4基因突 变谱， 同时所提供的试剂盒特异性强、 灵敏度高， 无需温度循环， 操作简单， 为临床上 Stargardt病的检测提供了指导。 [0007]本发明首先对我国一个患有Stargardt病的家系进行了研究， 通过全外显子测序，说　明　书 1/7 页 3 CN 114480624 A 3