(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210182834.3 (22)申请日 2022.02.25 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114574631 A (43)申请公布日 2022.06.03 (73)专利权人 广州凯普医药 科技有限公司 地址 510555 广东省广州市黄埔区九龙镇 中新知识城凤凰三横路71号2号试剂 车间四楼 (72)发明人 曹素梅　吴智聪　谢尚杭　林冬丰　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 赵崇杨 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01)C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (56)对比文件 CN 113481295 A,2021.10.08 CN 109609638 A,2019.04.12 审查员 姜紫耀 (54)发明名称 一种用于定量检测EB病毒Cp启动子甲基化 的试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种用于定量检测EB病毒Cp 启动子甲基化的试剂盒。 所述试剂盒包括用于扩 增EB病毒Cp启动子序列的特异性引物、 甲基化与 未甲基化检测Taqman探针、 50％甲基化标准品、 亚硫酸氢盐转化质控品、 EB病毒Cp启动子100％ 甲基化标准品和100％未甲基化标准品。 利用本 发明所述试剂盒定量检测时， 无需进行巢式预扩 增反应， 也无需分开检测甲基化和未甲基化序 列， 只需将转化后的DNA加入到反应体系中， 即可 在一管反应中同时检测甲基化和未甲基化序列， 快速、 简便， 克服了现有鼻咽癌筛查指标阳性预 测值低、 灵敏度低和特异度低的问题。 权利要求书1页 说明书11页 序列表3页 附图3页 CN 114574631 B 2022.12.30 CN 114574631 B 1.一种用于定量检测EB病毒Cp启动子甲基化的试剂盒， 其特征在于， 包括一对用于扩 增EB病毒Cp启动子序列的特异性引物， 其序列依次如SEQ  ID NO.1～2所示； 甲基化检测探 针， 其序列如SEQ  ID NO.3所示； 未甲基化检测探针， 其序列如SEQ  ID NO.4所示； EB病毒Cp 启动子100％甲基化标准品， 其序列如SEQ  ID NO.7所示； EB病毒Cp启动子100％未甲基化标 准品， 其序列如SEQ  ID NO.8所示； 50％甲基化标准品， 其序列如SEQ  ID NO.9所示； 以及亚 硫酸氢盐转 化质控品， 其序列如SEQ  ID NO.10所示。 2.根据权利要求1所述试剂 盒， 其特征在于， 所述甲基化与未甲基化检测探针的5'端带 有不同的荧 光基团， 所述 荧光基团为FAM、 TET、 JOE、 VIC、 ROX、 Texas  red或Cy5 。 3.根据权利要求1所述试剂 盒， 其特征在于， 所述甲基化与未甲基化检测探针的3'端带 有淬灭基团， 所述淬灭基团为MGB、 BHQ1、 BHQ2或BHQ3 。 4.根据权利 要求1～3任一所述试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中还包含RT ‑qPCR所需 试剂。 5.根据权利要求4所述试剂盒， 其特征在于， 利用所述试剂盒进行甲基化定量检测时， 检测样本来源为鼻咽拭子、 口腔拭子、 鼻咽或口咽活检组织、 血浆或血清。 6.根据权利要求4所述试剂盒， 其特征在于， 利用所述试剂盒进行甲基化定量检测时， 扩增反应程序为： 95℃预变性5分钟， 1个循环； 变性95℃15秒， 60℃退火延伸50秒， 45个循 环。 7.根据权利要求4所述试剂盒， 其特征在于， 利用所述试剂盒进行甲基化定量检测时， 在退火延伸阶段采集 荧光信号， 同时收集甲基化/未甲基化探针水解所对应的荧 光。 8.根据权利要求4所述试剂盒， 其特征在于， 利用所述试剂盒进行甲基化定量检测时， 甲基化率＝甲基化序列含量/(甲基化序列含量+未甲基化序列含量)计算甲基化水平。 9.根据权利要求8所述试剂盒， 其特征在于， 所述甲基化率的计算公式为： 甲基化率＝ (2X)△CT/((2X)△CT+1)； 其中， X为PC R扩增效率， △CT为未甲基化探针与甲基化探针的CT值之 差； X值需要根据使用者的RT ‑qPCR仪进行调整， 默认情况 下该值为1。 10.本发明权利要求1～ 9任一所述试剂盒在制备 鼻咽癌早筛产品中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574631 B 2一种用于定量 检测EB病毒Cp启动子甲 基化的试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于基因甲基化检测技术领域。 更具体地， 涉及一种用于定量检测EB病毒 Cp启动子甲基化的试剂盒。 背景技术 [0002]甲基化修饰是生物体内最广泛的表观遗传学修饰方式之一， 是指在特定的酶的作 用下将甲基基团催化转移到其他化合物的过程， 主要包括DNA甲基化、 RNA甲基化和蛋白质 甲基化。 DNA甲基化一般出现于DNA的CpG岛， 即胞嘧啶5号碳位甲基化(m5C)。 当甲基化发生 于基因启动子区域时， 通常会抑制基因的转录， 导致其对应基因的表达量降低。 DNA异常甲 基化则几乎出现在所有肿瘤的癌前病变和癌症癌变早期， 因此， 是肿瘤早期诊断的理想标 志物。 [0003]EB病毒(Epstein ‑Barr virus)， 又称人类疱疹病毒第四型(Human  herpesvirus4， HHV‑4)， 是最常见的能引起人类疾病的病毒之一， 该病毒主要感染人B淋巴细胞。 EB病毒的 感染是鼻咽癌发生的主要危险因素， EB病毒相关甲基化检测能有效预测鼻咽癌的发生发 展。 [0004]目前， 甲基化定量检测的方法包括焦磷酸测序(Pyrosequencing)、 飞行时间质谱 法(MassARRAY)、 甲基化敏感性高分辨率溶解曲线分析(MS ‑HRM)和甲基化特异性PCR(MS ‑ PCR)等， 但上述方法均存在检测所需样本量高(需达到 μg级别)， 检测时间长以及检测成本 高等问题。 当检测样本的DNA含量低时， 上述方法还需进行巢式扩增以提高目标基因含量， 而巢式扩增引起的扩增偏好可能会使定量结果产生偏移， 且巢式扩增后开盖加样容易引物 引起因扩增带来的气溶胶污染， 进 而造成检测结果的假阳性。 [0005]基于实时荧光定量PCR的Methylight是一种低成本的甲基化检测方法， 但该方法 需要借助一个参比基因进行结果校正， 其结果的稳定性和准确性会受参比基因表达量影 响。 中国专利 《一种DNA甲基化定量系统》 在Methylight方法的基础上， 提出了一种依靠RT ‑ qPCR反应的CT值进行定量， 不需参比基因的定量检测方法。 但由于该专利 所述方法的CT值 是由RT‑qPCR仪自动生成， 在实际反应中， RT ‑qPCR仪自动生成 的CT值易受探针荧光基团发 光强度、 反应 体系、 反应条件等多因素影响， 检测结果并非完全稳定 。 发明内容 [0006]本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足， 提供一种用于定量 检测EB病毒Cp启动子甲基化的试剂盒。 [0007]本发明的第一个目的是提供一种用于 定量检测EB病毒Cp启动子甲基化的试剂盒。 [0008]本发明的第二个目的是提供 所述试剂盒在制备 鼻咽癌早筛产品中的应用。 [0009]本发明上述目的通过以下技 术方案实现： [0010]本发明提供了一种用于定量检测EB病毒Cp启动子甲基化的试剂盒， 所述试剂盒包 括一对用于扩增EB病毒Cp启动子序列的特异 性引物、 甲基化检测探针、 未甲基化检测探针、说　明　书 1/11 页 3 CN 114574631 B 3