(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221018742 2.9 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 上海海关动植物与食品检验检疫技 术中心 地址 200135 上海市浦东 新区民生路1208 号 (72)发明人 王强　蔡一村　宁雪　张晨　 许镇坚　潘良文　 (74)专利代理 机构 上海华工专利事务所(普通 合伙) 31104 专利代理师 赵孟琴　缪利明 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 利用单拷贝核基因检测食品和饲料中火鸡 源性成分的实时荧 光PCR检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用单拷贝核基因检测 食品和饲料中火鸡源性成分的实时荧光PCR检测 方法， 包括以下步骤： 第一步， 以待测样品的DNA 为模板， 进行荧光定量PCR扩增， 获得PCR扩增产 物； 第二步， 检测扩增产物的荧光信号； 第三步， 以检测结果的Ct值判定样品中是否含有火鸡源 性成分； 其中， 用于PCR扩增的反应体系中含有扩 增火鸡源性成分的特异性引物对和火鸡源性成 分的特异性探针。 本发明的火鸡源性成分的实时 荧光PCR扩增的特异性引物对和探针不仅特异性 好， 而且灵敏度高， 为快速准确地检测食品和饲 料中是否含有火鸡源性成分提供了一种定量检 测方法， 具有较好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图2页 CN 114836523 A 2022.08.02 CN 114836523 A 1.一种利用单拷贝核基因检测食品和饲料中火鸡源性成分的实时荧光PCR检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 第一步， 以待测样品的DNA为模板， 进行荧 光定量PCR扩增， 获得PCR扩增产物； 第二步， 检测扩增产物的荧 光信号； 第三步， 以检测结果的Ct值判定样品中是否含有火鸡源性成分以及定量检测样品中的 火鸡源性成分的含量； 其中， 用于PCR扩增的反应体系中含有扩增火鸡源性成分的特异性引物对和检测火鸡 源性成分 的特异性探针， 所述扩增火鸡源性成分的特异性引物对的序列如SEQ  ID NO.1和 SEQ ID NO.2所示， 所述检测火鸡源性成分的特异性探针的序列如SEQ  ID NO.3所示。 2.如权利要求1所述的实时荧 光PCR检测方法， 其特 征在于， 所述PCR扩增的条件如下： 反应体系为25μL： 2 ×实时荧光PCR试剂12.5μL， 引物各10μM， 1μL； 10μM探针0.5μL， 20ng/ μL DNA模板5 μL； PCR反应条件： 95℃10mi n； 95℃15s， 6 0℃1min； 共45个 循环。 3.一种火鸡源性成分的检测试剂盒， 其特 征在于， 含有以下 试剂： (a)扩增火鸡源性成分的特异性引物对； (b)检测火鸡源性成分的特异性探针； 其中， 所述扩增火鸡源性成分的特异性引物对的序列如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所 示， 所述检测火鸡源性成分的特异性探针的序列如SEQ  ID NO.3所示。 4.根据权利要求3所述的检测试剂盒， 其特 征在于， 所述检测试剂盒还 包括： (c)标准参照物。 5.一种如权利要求3或4所述的检测试剂盒的应用， 其特征在于， 所述检测试剂盒用于 定性或定量检测食品或饲料中的火鸡源性成分。 6.一种检测火鸡源性成分的特异性引物对和探针， 其特征在于， 所述特异性引物对的 序列如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示， 所述特异性探针的序列如SEQ  ID NO.3所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114836523 A 2利用单拷贝核基因检测食品和饲料 中火鸡源性成分的实时荧 光PCR检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物工程领域， 具体地说， 是关于一种利用单拷贝核基因检测食品和   饲料中火鸡源性成分的实时荧 光PCR检测方法。 背景技术 [0002]常见的肉及肉制品真伪鉴别技术主要包括： (1)基于蛋白质分子结构的免疫分析   技术等； 基于蛋白大分子结构的免疫分析方法具有高灵敏度、 高通量、 操作简 便的特 点， 可 实现对大量样品的快速检测。 例如， Macedo ‑Silva等通过制备抗牛、 鸡、 猪、  马白蛋白的抗 血清建立了ELISA方法用于鉴别汉堡中可能掺入的廉价肉类成分， 灵敏  度可达0.6％。 但 是， 基于抗原 ‑抗体特异性结合的免疫分析方法对于亲缘关系较近的  物种易出现交叉反 应。 蛋白质三级结构在食物加工过程中可能受到破坏而影响抗体识  别也是该方法的重要 不足之处。 (2)基于核酸的分子生物学技术， 如PCR、 实时荧光  PCR和分子指纹技术等； 基于 DNA序列特异性的分子生物学技术以动物种属间遗传信  息的差异作为 肉种鉴别的检测靶 点而被广泛使用。 相比于蛋白质， DNA由于热稳定性  高， 在加工过程中虽然存在一定程度的 降解， 但仍能提取出小片段DNA用于PCR等分  析。 同时DNA具有特异性高、 灵敏度高、 不受组 织类别限制等诸多优势， 对于亲缘关  系较近的物种具有较高的分辨能力。 近年来， 基于DNA 检测技术的肉及肉制品真实性  鉴别方法的研究越来越多。 目前主要集中于以P CR为基础的 各类分析方法， 其中包括  DNA测序、 多重PCR、 实时荧光定量PCR等。 特别是实时荧光定量P CR 技术在动物源  性成分的检测领域， 已成为主流检测技 术。 [0003] [0004] [0005]PCR技术通过一段特异的寡核苷酸与目标DNA序列结合而在 体外合成数以百万  计 的DNA拷贝。 通过物种特异性引物对DNA片段进 行扩增， 通过琼脂糖电泳 分离并观  察特异性 条带是PCR技术鉴别物种成分 的最基本方法。 线粒体DNA在细胞中拷贝数量  大、 灵敏度高、 进化速度快， 具有较高的种间多样性和较低的种内变异， 已被广泛应  用于引物设计和靶序 列的扩增。 如常用的线粒体基因有细胞色素b基因、 12S和16S  核糖体RNA亚基、 D ‑loop区。 但 是， 由于线 粒体DNA序列的拷贝 数高且不恒定， 只  能应用于动物源性成分的定性检测， 很难 应用于定量检测。 “Species identification  and quantification  in meat and meat  products  using droplet digital  PCR(ddPCR)Analytical  Methods ”,C.Floren, I.Wiedemann,B.Brenig,  E.Schütz,J.Beck,Food  Chemistry  173(2015)1054 –1058， 该文 章的结论明确  了在定量的时候使用线粒体源的引物和探针会引起结果偏差 。 [0006]目前国内外检测动 物成分的引物和探针一般都是针对线粒体基因设计的， 线粒体   基因在细胞中的拷贝数在5000 ‑6000拷贝或更多。 但在实际研 究工作中发现： 利用多  拷贝 的线粒体基因设计出一套引物和探针进行检测时， 其Ct值可低达为13左右， 如  此低的Ct 值， 当样品中动物源性成分在0.00000001％时， Ct值仍然在37左右。 在目  标检测物如此低说　明　书 1/8 页 3 CN 114836523 A 3