(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210185976.5 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 广东海大 畜牧兽医研究院有限公司 地址 511400 广东省广州市番禺区沙 头街 小平工业区福平路 八街5号 (72)发明人 陶攀　贾爱卿　王贵平　东笑　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 林德强 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 用于检测牛呼吸道疾病的引物探针组合、 试 剂盒及其应用 (57)摘要 本发明属于牛呼吸道病原检测技术领域， 公 开了用于检测牛呼吸道疾病的引物探针组合、 试 剂盒及其应用， 具体公开了一种试剂， 包括引物 组和/或探针组。 本发明提供的试剂可用于同时 检测牛传染性鼻气管炎病毒、 牛病毒性腹泻病毒 和牛支原 体， 实现在一管反应中只进行1次PCR扩 增即可对3种牛呼吸道疾病的病原进行检测。 权利要求书2页 说明书17页 序列表4页 附图2页 CN 114634996 A 2022.06.17 CN 114634996 A 1.一种试剂， 包括引物组和/或探针组， 所述引物组和探针组的核苷酸序列如下 所示： 所述引物组用于检测牛传染性鼻气管炎病毒、 牛病毒性腹泻病毒和/或牛支 原体； 其中， 所述检测牛传染性鼻气管炎病毒的引物为： IBRV‑F1： 5’ ‑ACGACGGACGATGTGTAC ‑3’， 或为该序列的互补序列； IBRV‑R1： 5’ ‑GAACGAGTCGTACG GGTA‑3’， 或为该序列的互补序列； 所述检测牛病毒性腹泻病毒的引物为： BVDV‑F1： 5’ ‑GGCCCACTGTAT TGCTACT‑3’， 或为该序列的互补序列； BVDV‑R1： 5’ ‑CTGGTCGTAAACAGGTTCC‑3’， 或为该序列的互补序列； 所述检测牛支 原体的引物为： Mb‑F2： 5’ ‑AAAGAACACCCAGAAGCTAAGA‑3’， 或为该序列的互补序列； Mb‑R2： 5’ ‑AACTGGATATGAAGCTGTGGC‑3’， 或为该序列的互补序列； 所述探针组用于检测牛传染性鼻气管炎病毒、 牛病毒性腹泻病毒和/或牛支 原体； 其中， 所述检测牛传染性鼻气管炎病毒的探针为： IBRV‑P： 5’ ‑CGCCTCCACTTCTTCCACGATGC ‑3’， 或为该序列的互补序列； 所述检测牛病毒性腹泻病毒的探针为： BVDV‑P： 5’ ‑CTGTACATG GCACATGGAGTTGA‑3’， 或为该序列的互补序列； 所述检测牛支 原体的探针为： Mb‑P： 5’ ‑ACTTCTGGTGAACCCGTTGCAGTTGCTGC‑3’， 或为该序列的互补序列。 2.根据权利要求1所述的试剂， 其特征在于， 所述检测牛传染性鼻气管炎病毒的探针、 所述检测牛病毒性腹泻病毒的探针和所述检测牛支原体的探针的序列两端均分别标记有 荧光基团和淬灭基团， 各探针序列之间标记的荧 光基团不同。 3.根据权利要求2所述的试剂， 其特征在于， 所述荧光基团为FAM、 VIC、 TAMRA、 ROX和CY5 中的至少一种； 所述淬灭基团优选为BHQ1、 BHQ2和BHQ3中的至少一种。 4.一种试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒包 含权利要求1～3中任一项所述的试剂。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括PCR反应液、 酶、 阴性 参考品和阳性 参考品。 6.根据权利要求5所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述酶包括TaqDNA聚合酶和逆转录酶。 7.权利要求1～3中任一项所述的试剂或权利要求4～6中任一项所述的试剂盒在(1)～ (6)中任一项的应用； (1)鉴别牛传染性鼻气管炎病毒、 牛病毒性腹泻病毒和/或牛支 原体； (2)制备检测牛传染性鼻气管炎病毒、 牛病毒性腹泻病毒和/或牛支 原体的产品； (3)检测待测样品是否为牛传染性鼻气管炎病毒、 牛病毒性腹泻病毒或牛支 原体； (4)制备待测样品是否为牛传染性鼻气管炎病毒、 牛病毒性腹泻病毒或牛支原体的产 品； (5)检测待测样品是否感染牛传染性鼻气管炎病毒、 牛病毒性腹泻病毒和/或牛支原 体； (6)制备检测待测样品是否感染牛传染性鼻气管炎病毒、 牛病毒性腹泻病毒和/和牛支 原体的产品； 上述应用 用于非疾病的诊断和治疗。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114634996 A 28.一种同时检测牛传染性鼻气管炎病毒、 牛病毒性腹泻病毒和牛支原体的多重荧光 PCR检测方法， 包括以下步骤： 1)从待测样品中提取核酸； 2)以步骤1)的核酸为模板， 用权利 要求1～3中任一项所述的试剂或权利 要求4～6中任 一项所述的试剂盒进行多重荧 光PCR扩增反应， 收集 荧光信号； 3)根据荧光信号判定样品中是否含有牛传染性鼻气管炎病毒、 牛病 毒性腹泻病毒和牛 支原体； 上述方法用于非疾病的诊断和治疗。 9.根据权利要求8所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤2)中多重荧光PCR扩增反应 体系为： 10.根据权利要求9所述的检测方法， 其特征在于， 所述步骤2)中多重荧光PCR扩增反应 程序为： 40～45℃， 4～ 6min； 94～9 6℃， 25～35s； 90～95℃4～6s， 52～62℃30s， 35～40个循 环。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114634996 A 3