(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210184664.2 (22)申请日 2022.02.28 (71)申请人 天津师范大学 地址 300387 天津市西青区 宾水西道393号 天津师范大学 (72)发明人 张亦陈　刘逸尘　孙金生　 (74)专利代理 机构 天津市杰盈专利代理有限公 司 12207 代理人 朱红星 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6816(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测中华绒螯蟹酚氧化酶原基因 表达的特异性探 针及应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测中华绒螯蟹酚 氧化酶原基因表达的特异性探针及应用。 本发明 在基因的保守区域设计探针序列， 利用荧光标记 的探针特异性结合目的基因mRNA的原理， 引入流 式细胞术进行高通量和高精度的自动化测量， 可 以准确辨识单细胞样点， 并定量 分析胞内荧光强 度， 以获得目的基因在mRNA表达水平的量化信 息。 基于上万样点的结果的准确性、 可靠性和重 复性远超人工观察计数等常规方法。 本发明不需 抗体， 成本低， 基于流式的高通量自动化分析效 率高， 可靠性 好， 有很大的应用潜力。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图2页 CN 114410805 A 2022.04.29 CN 114410805 A 1.一种用于检测中华绒螯蟹酚氧化酶原基因表达的特异性探针序列5 ’‑   TAGACGAGGTGCCAGTGCCAGT   ‑3’， SEQ ID NO: 1， 该序列分别 与中华绒螯蟹酚氧化酶原基因 mRNA序列 （GenBank:  EF493829.1） 的643 ‑664位以及凡纳滨对虾酚氧化酶原基因mRNA序列 （GenBank:  EU373096.1） 的710 ‑731位序列完全互补， 该探针经5端FAM荧光标记后， 可利用 图像流式细胞仪等常规仪器对 靶基因表达进行量 化分析。 2.权利要求1所述的探针序列在具有与探针互补的同源序列的其它甲壳动物酚氧化酶 原基因表达分析和检测方面的应用。 3.基于权利要求1所述探针序列开发分析检测相关产品及应用。 4.权利要求1所述 述探针序列的制备和使用方法， 其特 征在于按如下步骤进行： （1） 根据目标基因序列设计并合成探针， 采用末端偶联荧 光基团标记探针； （2） 采集血细胞， 经固定和透化后制备用于 探针杂交的细胞样本； （3） 参考常规分子杂交方法， 短时间高温打开复杂结构， 用去离子甲酰胺降低杂交温 度， 以保护细胞 形态； （4） 细胞筛过 滤后上机测量侧向散射和荧 光强度等 参数以及图像信息用于分析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410805 A 2一种用于 检测中华绒螯蟹酚氧化酶原基因表达的特异性探针 及应用 [0001]本专利申请由天津师范大学生命科学学院/天津市动植物抗性重点实验室完成， 得到天津市应用基础与前沿技术研 究计划 （19JCYB JC29700） ， 天津市水产生态及养殖重点 实验室开 放基金(TJAE2015 005)。 技术领域 [0002]本发明属于检测技术领域， 涉及一种基于探针序列与目标序列特异性且按比例结 合原理， 将荧光原位杂交与流式细胞术相结合， 进行单细胞水平基因表达测 量和细胞分类 的自动化检测方法。 本方法不依赖抗体， 直接根据 功能基因的mRNA保守区合成探针序列， 先 进的流式测量模块进一步避免了 “因人而异 ”的误差， 高通量检测能力是本方法大规模应用 的效率保障。 因此， 本发明在理论和实 践的分析和检测中都具有很高的应用价 值。 背景技术 [0003]甲壳动物免疫防御体系由许多重要的免疫应答系统构成。 酚氧化酶原(   Prophenoloxidase， proPO)激活系统是其体内一种极为重要的免疫反应机制， 其酚氧化酶 （Phenoloxidase， PO） 的活力与机体的免疫水平密切相关， 可用作评价甲壳动物免疫功能强 弱的关键指征。 贻贝 血细胞中的pr oPO含量是其血淋巴中含量的20倍， 而在甲壳动物血淋巴 中的proPO几乎全部来自血细胞， 特别是其中的颗粒细胞。 细菌和酵母等的表 面多糖以及钙 离子或者胰蛋白酶等物质可以通过丝氨酸蛋白酶间接激活proPO成为具有功能活性的酚氧 化酶(phen oloxidase , PO)。 [0004]酚氧化酶是一种含有铜的酪氨酸酶(  tyrosinase)， 能够催化单酚羟化成二酚， 进 而氧化成化成醌， 醌再转化形成黑色素。 在黑化包被反应中， 这些黑色素与具有细胞毒性的 醌类等中间产 物聚集到病原附近， 从而隔离并杀死病原。 pr oPO激活系统相关蛋白也在宿 主 非自身识别过程中承担防御反应功能， 如识别异物、 促使颗粒细胞释放胞内颗粒； 产生多种 介导凝集的因子及抗菌肽等免疫功能分子进一步发挥免疫作用， 如释放调理素、 促进血细 胞的吞噬和包囊反应等。 研究表明中国明对虾被白斑综合征病毒 （White  spot syndrome   virus,WSSV） 感染后其酚氧化酶原基因表达水平 明显上调。 在较高等的无脊椎动物如节肢 动物中， 除了黑色素 形成之外， PO还具有促进角质的硬化和伤口愈合 等功能。 [0005]流式细胞仪是一种集成了多个学科和领域先进科学原理的高科技测量设备， 整合 了包括现代免疫荧光技术、 流体力学、 激光学、 应用电子学以及计算机等技术。 它 可以对细 胞大小、 长宽、 细胞内容物折射情况等进 行快速、 定量、 多参数的检测。 借助抗体或探针还可 同时用于定量检测胞外抗原或细胞内的核酸量， DNA 倍性或开展细胞周期、 细胞因子以及黏 附分子等分析。 细胞亚群分析经常用到各种 特异性抗体， 借助流式细胞术可以准确 辨识荧 光标记抗体信号， 从而区分不同类型或不同发育分化 阶段的细胞。 医学血液学分析中的各 类血细胞研究主要采用了抗体标记和流式检测相结合的方法。 由此可见， 一系列特异性抗 体或探针在 细胞分类和功能研究中具有极其重要的作用。说　明　书 1/8 页 3 CN 114410805 A 3